蓝舌病病毒和鹿流行性出血热病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时检测蓝舌病病毒(BTV)和鹿流行性出血热病毒(EHDV)的快速诊断方法,本研究根据BTV和EHDV保守基因序列设计特异性引物和探针,建立了双重荧光定量RT-PCR,对该方法进行反应条件、特异性及敏感性的验证,并用该方法对部分已知临床样品进行检测。结果显示,该方法与口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒、小反刍兽疫病毒等牛、羊常见疾病病原无交叉反应;对两种重组质粒标准品的检出极限均为1×10~2copies/L;批内和批间重复试验的变异系数均小于2.55%。临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样品中BTV和EHDV的核酸。结果表明,本研究建立的检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以为BTV和EHDV的快速鉴别检测及流行病学调查提供有效的技术手段。     

新血清型流行性出血病病毒荧光定量qRT-PCR与RT-PCR检测方法的建立及应用

流行性出血病病毒(EHDV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒。目前世界范围已发现9种血清型的EHDV,2018年笔者在云南芒市新分离到1株新血清型EHDV毒株(YNDH/V079/2018),但尚缺乏该血清型的特异性检测方法。本研究建立了新血清型EHDV核酸检测的实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和RT-PCR方法。试验结果显示,建立的两种方法均具有良好的特异性与灵敏度,与另外7种血清型EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)、阿卡斑病毒(AKAV)和阴性对照均无交叉反应。对病毒核酸的检测下限分别达到10 copies/μL(qRT-PCR)与10~2copies/μL(RT-PCR)。临床样品检测显示,qRT-PCR能在动物感染EHDV早期检测鉴定出病毒,更适合应用于检测病毒载量较低的血液样品。RT-PCR的扩增产物可以胶回收测序,进一步了解待测病毒的遗传信息,两种方法辅助使用,为新血清型EHDV的早期快速诊断、流行病学调查和试验研究等提供了有效的技术方法。     

流行性出血病病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立流行性出血病病毒(EHDV)群特异性核酸检测方法,本研究根据GenBank中登录的EHDV毒株内衣壳结构蛋白VP7基因的保守区,设计并合成1对特异性引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感度和临床样品的检测试验。结果表明,该方法能特异性地检出不同地区分离的不同血清型EHDV,而对蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)和赤羽病病毒(AKAV)无交叉反应,具有较好的特异性;不同血清型的EHDV最低检出量级为1×10~2copies/uL。同时,该方法能有效地从临床抗凝血样品中检测出EHDV核酸,与病毒分离试验结果进行比较,符合率为100%。说明所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于EHDV的快速检测、流行病学调查和试验研究。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立西藏环状病毒(TIBOV)群特异性核酸检测方法,本研究根据云南师宗新分离的TIBOV(YNSZ/V290/2019)毒株和GenBank中登录的TIBOV毒株VP6基因序列的保守区,设计并合成特异性引物和探针,建立了荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、灵敏性和临床样品的检测。试验结果表明,两种检测方法均可特异性地扩增TIBOV及检出特异荧光信号,而对帕利亚姆血清群病毒(PALV)、蓝舌病病毒(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)、广西环状病毒(GXOV)、阿卡斑病毒(AKAV)、云南环状病毒(YNOV)、非洲马瘟病毒(AHSV)和牛流行热病毒(BEFV)无扩增和无有效荧光信号检出,具有较好的特异性。灵敏性试验结果显示,荧光定量RT-PCR检测TIBOV核酸的下限可达10 copies/μL,常规RT-PCR的检测下限为10~2copies/μL。临床样品检测显示,两种方法均能检测出库蠓样品中的TIBOV核酸,常规RT-PCR扩增产物经测序和BLAST比对分析显示,库蠓样品中检测到的TIBOV与NCBI数据库中TIBOV(DH13C120、XZ0906、D181/2008)毒株VP6基因序列相似度均在95%以上。荧光定量RT-PCR因其更高的灵敏度和实效性,能用于大量临床样品的快速检测,而常规RT-PCR可以对扩增产物进行胶回收测序,进一步了解待测病毒的遗传信息。两种方法相互辅助,可以为TIBOV的早期诊断、快速检测、流行病学调查和实验研究等提供有效的技术方法。     

帕利亚姆病毒血清型特异性RT-PCR检测方法的建立

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)包含多种血清型病毒,我国存在Chuzan virus(CHUV)、Bunyip Creek virus (BCV)和D'Aguilar virus (DAV)三种血清型PALV毒株的流行,目前尚无PALV血清型特异性RT-PCR检测方法的报道。本研究根据获取的中国CHUV、BAV和DAV这三种PALV血清型毒株的Seg-2序列,设计合成了3对特异性引物,建立了PALV血清型特异性一步法RT-PCR检测方法。灵敏度试验结果显示,CHUV、BCV和DAV血清型鉴定引物可分别检测到1.3×10~2 copies、8.0×10~2 copies和5.5×10~2 copies的核酸;特异性试验结果表明,本研究建立的PALV血清型特异性检测方法与蓝舌病病毒(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)、非洲马瘟病毒(ASHV)均无交叉反应。本研究建立的PALV血清型特异性RT-PCR检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,为开展PALV的诊断与流行病学监测提供了有效的技术手段。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立西藏环状病毒（TIBOV）群特异性核酸检测方法，本研究根据云南师宗新分离的TIBOV（YNSZ/V290/2019）毒株和GenBank中登录的TIBOV毒株VP6基因序列的保守区，设计并合成特异性引物和探针，建立了荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR检测方法，并分别进行了特异性、灵敏性和临床样品的检测。试验结果表明，两种检测方法均可特异性地扩增TIBOV及检出特异荧光信号，而对帕利亚姆血清群病毒（PALV）、蓝舌病病毒（BTV）、流行性出血病病毒（EHDV）、广西环状病毒（GXOV）、阿卡斑病毒（AKAV）、云南环状病毒（YNOV）、非洲马瘟病毒（AHSV）和牛流行热病毒（BEFV）无扩增和无有效荧光信号检出，具有较好的特异性。灵敏性试验结果显示，荧光定量RT-PCR检测TIBOV核酸的下限可达10 copies/μL，常规RT-PCR的检测下限为10~(2 )copies/μL。临床样品检测显示，两种方法均能检测出库蠓样品中的TIBOV核酸，常规RT-PCR扩增产物经测序和BLAST比对分析显示，库蠓样品中检测到的TIBOV与NCBI数据库中TIBOV（DH13C120、XZ0906、D181/2008）毒株VP6基因序列相似度均在95%以上。荧光定量RT-PCR因其更高的灵敏度和实效性，能用于大量临床样品的快速检测，而常规RT-PCR可以对扩增产物进行胶回收测序，进一步了解待测病毒的遗传信息。两种方法相互辅助，可以为TIBOV的早期诊断、快速检测、流行病学调查和实验研究等提供有效的技术方法。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法在2.31×10~8～2.31×10~2copies/μL质粒标准品浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999;组内与组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为2.31×10~1copies/μL;对蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、盖塔病毒和流行性乙型脑炎病毒检测结果均为阴性,无交叉反应;对云南新分离的9株西藏环状病毒进行检测,拷贝数在3.23×10~5～1.54×10~6copies/μL之间,准确率为100%;对2013年采集自云南江城县的48份牛血液样品进行检测,检出西藏环状病毒阳性3份。结果表明,本研究建立的西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于西藏环状病毒的快速检测,对西藏环状病毒的检测和流行病学调查提供了技术手段。     

猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计引物和Taq Man探计,通过优化反应体系,建立了猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。结果显示,建立的方法能特异性检测猪嵴病毒,与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应,对标准品的检测灵敏度达10 copies/L;标准曲线Ct值和模板终浓度在107~10 copies/L范围内有良好的线性关系;重复性试验变异系数均小于2.5%。对139份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR阳性检出率为30.94%(43/139),常规RT-PCR为29.50%(41/139)。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪嵴病毒的快速检测和流行病学调查。     

水泡性口炎病毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)的快速鉴别检测方法,本研究根据水泡性口炎病毒2种血清型相对保守的L基因为靶序列,分别设计2对型特异性引物和2条不同荧光基团修饰的探针。经过对反应体系的优化,建立了能够同时检测VSV-IND和VSV-NJ的双重荧光RTPCR方法。该方法能准确鉴别VSV两种血清型,与口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无非特异性扩增,特异性强。与普通RT-PCR相比,反应快速、灵敏度高。Ct值的变异系数小于3%,重复性好。利用所建立方法对126份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR相同。上述结果表明,本研究建立的方法为VSV-IND和VSV-NJ的同时鉴别检测提供了一种快速、特异和敏感的方法。     

猪塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

本研究根据猪塞尼卡病毒(SVA)VP1基因保守序列设计引物,通过优化反应条件,建立了实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对其进行特异性、敏感性和重复性的评价。结果显示,该检测方法特异性好,灵敏度达10 copies/uL,变异系数均小于2.0%,操作简单,耗时短。利用建立的检测方法对124份临床样本进行检测,结果,阳性率为3.2%。上述结果表明,本研究建立的荧光定量RT-PCR方法可用于猪原发性水泡病临床样品的快速检测和流行病学调查,具有良好的应用前景。     

蓝舌病病毒10型和20型及23型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典毒株的序列差异,分别设计了1对特异性鉴别引物和1条TaqMan探针,建立了检测PRRSV变异株的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,建立的方法可鉴别诊断PRRSV变异株和经典毒株,具有较高的特异性;可以检测相当于1TCID50的病毒模板,比常规RT-PCR方法的灵敏度高100倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<10%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对13份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出11份阳性,高于常规RT-PCR方法。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法能检测高致病性PRRSV变异株,不仅特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于变异PRRSV的临床诊断和流行病学调查。     

山羊痘病毒及口疮病毒ITR-059基因双重PCR检测方法的建立

为实现山羊痘病毒(GTPV)和口疮病毒(ORFV)的同步快速检测,基于GTPV的ITR基因及ORFV的059基因,分别设计用于普通双重PCR的引物2对、用于二联实时荧光定量PCR的特异性引物及探针2套;探针分别用5′JOE-Eclipse3′及5′FAM-TAMRA3′荧光染料标记物进行标记。结果显示,所建立的GTPV-ITR-L-ORFV-059双重普通PCR方法,可实现对GTPV与ORFV的特异性双重检测,检测敏感度可达10~4copies/μL DNA;所建立的ITR-059二联探针实时荧光定量PCR方法可同时特异性检测ORFV和GTPV产生特异性荧光信号,二联探针的检测敏感度可分别达10~(2.87)和10~(2.52) copies/μL DNA。本研究初步建立了可同步特异性检测GTPV和ORFV的双重普通PCR及二联探针实时荧光定量PCR检测方法。     

猪环曲病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪环曲病毒N基因保守序列设计特异性引物与TaqMan探针,建立猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法能检测猪环曲病毒,而对猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪星状病毒、A群猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪嵴病毒和伪犬病病毒等核酸的检测均无交叉反应,具有良好的特异性;建立的定量标准曲线Ct值和模板终浓度在109~102copies/L范围内有良好的线性关系,该方法检测灵敏度可达102copies/L;重复性试验的组内、组间的变异系数均小于2.5%。对88份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR检出30份猪环曲病毒阳性,常规RT-PCR检出28份猪环曲病毒阳性,两种方法的符合率为93.34%。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪环曲病毒的快速检测和流行病学调查。     

蓝舌病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用将纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了3株(1F5、4E5和6A1)可以稳定分泌抗BTV VP7特异性单抗的杂交瘤细胞株.用纯化的BTV免疫家兔,按常规方法制备BTV多抗.选用抗VP7单抗(1F5)包被ELISA板,用兔抗BTV多抗作为捕获抗体,建立了BTV双抗体夹心ELISA检测方法.用该ELISA方法分别检测BTV、鹿流行性出血病病毒、水疱性口炎病毒、赤羽病病毒、小反刍兽疫病毒阳性样品.结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性.用该ELISA和RT-PCR同时检测259份临床样品,ELISA的特异性和敏感性分别为99.1%和85.7%,两种方法的符合率为97.7%.该方法的建立为BTV的检测及蓝舌病的流行病学调查提供了有效工具.     

鉴别蓝舌病病毒血清29型RT-PCR与qRT-PCR方法的建立与应用

为建立快速鉴别蓝舌病病毒血清29型(BTV-29)的方法,根据BTV-29型毒株基因节段2(Seg-2)的序列特征,分别设计用于RT-PCR与qRT-PCR方法的特异性引物与TaqMan探针,通过试验确定其敏感性,用BTV-1～BTV-24等核酸作为对照评价其特异性.对BTV-29感染动物血液样本中的病毒核酸进行监测,...     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较。结果显示,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R~2=1,其扩增效率E=2.03,熔解曲线为尖锐单峰;不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,具有较强的特异性;最低检出浓度(1×10~1copies/μL)比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性和稳定性好;将36份临床样品检测结果进行比较,与普通RT-PCR的总符合率为88.89%。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏度高,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

犬冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的犬冠状病毒(CCoV)S基因的保守序列设计并合成1对特异性引物,建立了一种快速、灵敏和特异的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,用于CCoV的检测。特异性试验结果表明,该方法特异性强,与犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、副流感病毒和犬细小病毒等无交叉反应;敏感性试验结果表明,它的最低检测限为4×10~1~5×10~1 copies/L,高于常规RT-PCR方法 10倍左右;批内和批间重复试验的变异系数均小于1.20%。利用该方法和普通RT-PCR方法分别对76份临床样品进行检测;结果显示,普通RT-PCR的阳性率为69.7%,实时荧光定量RT-PCR的阳性率为78.9%。对于60份阳性病料,随机选择2份病料进行病毒分离,用阳性血清中和其他外源病毒后都出现了CPE,进行RT-PCR扩增后测序,结果证实为CCoV。以上结果表明,本研究建立的方法可以为犬冠状病毒病的快速诊断及流行病学调查提供技术手段。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-LAMP检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守序列各设计一套LAMP引物,在同一体系中进行RT-LAMP扩增,通过对体系内引物浓度及反应温度等进行优化,建立了可在63℃恒温下对CSFV和PRRSV进行同步检测的LAMP方法,并进行了敏感性和特异性试验。结果显示,该方法的灵敏度与荧光定量RT-PCR相当,与常规RT-PCR相比高10倍;用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行RT-LAMP扩增,均未发生交叉反应。用该法对采自天津市4个猪场的52份临床样品进行检测,与荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100%。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,可实现两病原的同步快速检测,是临床疫病初筛技术的强有力候选。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用微芯片荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立一种可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用的核酸检测技术,本研究根据已发表的多株PRRSV ORF6(M)基因保守序列,设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种可用于PRRSV通检的微芯片荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,与多种常见的猪病病毒均无交叉反应;通检性好,可以检出包括美洲型、欧洲型、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及NADC30-like等多种基因型PRRSV毒株;灵敏性好,检测下限为1×10~1TCID_(50)/mL,与常规荧光RT-PCR方法一致;重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于4%;且成本低,模板用量少,反应快速,全程仅需61 min;对80份临床样品的检测结果与常规荧光RT-PCR的符合率为100%。本研究建立的微芯片荧光定量RT-PCR技术为PRRSV的快速、通用型检测提供了有力的技术支撑。