野鸭源新城疫病毒V蛋白抑制宿主细胞干扰素β产生的机制研究

为研究野鸭源新城疫病毒(ND V)V蛋白抑制宿主细胞干扰素β(IFN-β)产生的机制,构建真核表达新城疫病毒强、弱毒株V蛋白的重组载体,分别与IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/Ⅰ-Luc、AP-1-Luc报告质粒共转染H EK-293T细胞,接种仙台病毒刺激宿主细胞后,测定宿主细胞的相对荧光素酶活性。结果显示,新城疫病毒强毒株V蛋白(vNDV-V)能抑制NF-κB、AP-1、PRDⅢ/Ⅰ启动子活性,新城疫病毒弱毒株V蛋白(aNDV-V)能抑制NF-κB、AP-1启动子活性,进而抑制IFN-β的产生。构建新城疫强弱病毒V蛋白嵌合体进行试验,结果表明NDV强毒株V蛋白羧基端在抑制PRDⅢ/Ⅰ启动子活性中发挥关键作用。研究结果为深入研究V蛋白对抗宿主细胞天然免疫机制奠定了基础。     

贵州省鸡减蛋综合征病毒分离株的生物学特性鉴定

从贵州省出现产蛋下降等症状的鸡群中分离出１株病毒，命名为ＨＳ１。该病毒对鸭胚致死率达５５６％～６６７％；在尿囊液中产生高效价的红细胞凝集素，第７代鸭胚尿囊液的血凝效价达到２１５～１８；在ＤＥＦ单层细胞上生长良好，并引起明显的细胞病变，感染细胞的核内观察到嗜碱性包涵体；将分离毒株回归蛋用鸡复制出与自然病例相类似的临床症状，全部感染鸡都产生ＥＤＳ血清抗体；病毒呈球形粒子，直径７０～８０ｎｍ，无囊膜，对氯仿、乙醚不敏感；能凝集鸡、鸭、鹅的红细胞，不凝集哺乳动物的红细胞；病毒核酸类型是ＤＮＡ，不分节段，分子含有３３６ｋｂ。在交叉血细胞凝集抑制试验中，分离毒株对红细胞的凝集特性能够被ＡＶ１２７超免疫血清所抑制，而不与新城疫阳性血清、正常健康鸡血清发生交叉反应；在病毒中和试验中，ＨＳ１与ＡＶ１２７毒株能够发生交叉中和反应，显示它们具有相同的抗原关系。根据对病毒分离株的致病性、血凝谱、理化特性和血清学关系的鉴定，证明从贵州分离的ＨＳ１与国际标准毒ＡＶ１２７属于同一血清型，是１株ＥＤＳ病毒。     

鸡体内鹅源新城疫病毒抗原的免疫组织化学检测

为研究鹅新城疫(ND)的发病机理,用3株鹅新城疫病毒强毒株分别人工感染25日龄雏鸡,以单克隆抗体介导的免疫组化(IHC)法检测攻毒鸡体内NDV抗原的分布及定位,研究了鹅新城疫病毒(NDV)对鸡的组织嗜性.结果显示,在试验鸡多种组织器官中均能检测到NDV抗原,病毒抗原主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞、肝细胞及各种上皮细胞的胞浆内.结果表明,鹅NDV强毒株对鸡是一种泛嗜性病毒.     

鹅源新城疫病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank上鹅源新城疫病毒NA-1株M基因的序列,在保守区域设计并合成了1对引物,采用荧光嵌合法(SYBR Green Ⅰ)建立了检测鹅源新城疫病毒的实时荧光定量PCR(real-time PCR).以鹅源新城疫病毒NA-1株反转录产物cDNA为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线,并进行了融解曲线分析.结果,标准曲线的Ct值检测范围为23～36,相关系数(r2)为0.992;无引物二聚体及非特异性产物,且Tm=(83±0)℃.结果表明,建立的检测鹅源新城疫病毒实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏性高,能为以后快速诊断鹅源新城疫病毒提供有效保障.     

应用全血微量血球凝集抑制试验检测鸡新城疫抗体

自从Burnet(1942年)发现鸡新城疫病毒能凝集鸡红细胞,并能被鸡新城疫免疫血清特异性抑制以来,HI试验有了许多改进和创新。其中的β程序血清试管法,稀释病毒的血清试管法,血清微量法,血清平板法,都需要分离被检鸡血清和洗涤红细胞,还不够简便。快速全血平板法,对抗体效价低的鸡检出困难,或者精确判定抗体滴度不够。因而都有进一步     

鹦鹉副黏病毒的分离与鉴定

采集疑似自然感染新城疫病毒(NDV)的病死鹦鹉的肝、脾和胰腺,应用SPF鸡胚分离到1株病毒(YW-PMV),根据F基因片段测序结果,该病毒属于Ⅶh类,含有强毒株特征的蛋白酶识别序列RRRKRF,能凝集鸽红细胞,并能被新城疫阳性血清抑制,而不能被减蛋综合征(EDS)、禽流感H5、H7、H9血清抑制;电镜观察见到形态不规则、囊膜表面具有密集纤突的病毒粒子,直径100~200 nm。部分生物学特性表明,分离毒能致死鸡胚和番鸭胚,最小致死量和平均致死时间(MDT)分别为46.8 h和53 h;病毒接种鸡胚成纤维细胞和番鸭胚成纤维细胞均能引起细胞病变,并能被抗ND阳性血清中和;应用NDV荧光RT-PCR检测,该分离毒核酸为NDV阳性。上述结果初步表明该分离毒为鹦鹉副黏病毒强毒株。     

疫毒灵对新城疫病毒的灭活效果

疫毒灵对新城疫病毒的灭活效果常惠芸，卢永干（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）鸡新城疫是一种烈性病毒病，目前尚无有效疗法，给养鸡业带来巨大的经济损失，消毒是预防该病的一项重要措施。为了验证新型消毒剂——疫毒灵对新城疫病毒（ＮＤＶ）的灭活作用，...     

抗新城疫病毒因子抗病毒作用的研究

用新城疫病毒（ＮＤＶ）乳化疫苗免疫鸡，从高免卵黄中提取抗新城疫病毒因子，观察其对未免疫和免疫过的新城疫流行鸡群的治疗效果。结果对未免疫的新城疫流行鸡群的保护率为４４％（Ｐ＜０．０５）；对免疫过的新城疫流行鸡群的保护率为８９％（Ｐ＜０．００１）；临床治疗也显示出较好的效果。该因子在冰箱中贮存４ａ不失效。该制剂可能为防治鸡新城疫提供一种新的方法     

鸡新城疫快递诊断抗原制备方法

(一)原理 鸡新城疫快速诊断抗原是根据Zergar(1949)等的方法加以改进而研制成功的,其原理是加大抗原中病毒含量,使血球凝集加快。当抗原病毒含量固定,血清抗体可延缓血球凝集时间,随着抗体含量增加而延长;当抗体含量固定,则血球凝集时间与病毒含量之间成反比。因此,把抗原病毒含量固定到一定的数量上,就可用来测定血清中抗体含量。 二)种毒选择 快速诊断抗原要求病毒含量达到6～8秒可使血球发生凝集的强度,即2个平板凝集单位,相当试管法1280倍。因此,目前只能用Ⅱ系和Ⅳ系鸡新城疫病毒来制备抗原。     

鹅源新城疫病毒感染鸡的临诊症状及病理变化

用鹅源新城疫病毒BY株人工感染 2 5日龄雏鸡 ,同时用鸡新城疫病毒标准强毒F4 8E8株作为攻毒对照 ,观察 2株病毒感染鸡的临诊症状、病理变化 ,并加以比较。结果 ,2株病毒都可致试验鸡 1 0 0 %发病和死亡。BY组鸡于感染后 5 1h出现症状 ,发病后 4 8h全部死亡 ,主要大体病变为喉头严重出血、腺胃乳头或腺胃与肌胃交界处轻微出血、肠道黏膜局灶性出血坏死 ,病理组织学变化主要为消化器官和免疫器官内的细胞显著变性、坏死及出血等 ;F4 8E8组鸡于感染后 72h出现症状 ,发病后 36h感染鸡全部死亡 ,所表现的病理变化与BY组鸡相似 ,但腺胃和肠道的出血病变比BY组鸡显著     

新城疫疫苗毒与野毒的区别诊断及其多功能检测软件的开发

运用生物信息学软件对GenBank中收录的30株新城疫病毒(NDV)全基因组序列间的差异和它们对应的F基因片段22～420核苷酸序列间的差异进行了分析。发现这些差异高度相关(r=0.937),该片段可作为区分NDV野毒和疫苗毒的指纹序列。据此设计了1对扩增用简并引物(其中一条用于PCR产物的直接测序),建立了RT-PCR-测序技术,并测得2个参数:NDV标准疫苗指纹序列库和指纹序列的变异参数。在此基础上,开发出多功能自动分析软件,通过对该指纹序列的分析,不仅可以区分NDV疫苗毒和野毒,还能同步测定这些病毒的毒力和基因型。该技术对NDV标准毒株的测定结果与已知信息完全吻合,且只需3 d即可获得结果。对不同禽类(鹅、鸽、鸵鸟、鸡)中分离的NDV的测定结果表明,59%为残留的疫苗毒。     

新城疫病毒Mukteswar毒株反向遗传系统的建立

为了建立新城疫病毒(NDV)Mukteswar毒株的反向遗传操作系统,根据已测定的NDV Muk-teswar毒株的全基因组序列设计了5对引物,扩增出包含全基因组cDNA的5条片段,并按一定顺序依次克隆入pSL1180载体中,然后在cDNA 5′末端插入T7启动子序列,3′末端导入具有自我剪切功能的丁肝病毒核酶序列和T7转录终止信号,构建了能转录具有精确5′和3′末端全基因组cDNA的转录载体pNDVT7。将表达核蛋白、磷酸蛋白及转录大蛋白的辅助表达载体pCIneoNP、pCIneoP和pCIneoL与pNDVT7按一定比例混合共转染BRS-T7细胞,4 d后将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚,结果获得了高效价的重组病毒。表明本研究建立的反向遗传系统能高效、快速拯救重组新城疫病毒毒株。     

GFP标记的重组新城疫病毒HN基因乳酸菌表达载体的构建及原核表达

为构建具有示踪特性的新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸菌穿梭表达载体,采用PCR方法扩增NDV HN基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因,将两基因克隆至乳酸菌表达载体pW425et中,转化入表达宿主菌BL21(DE3)后利用IPTG诱导表达。用荧光显微镜检查重组菌的绿色荧光效应,采用SDS-PAGE和Western-blotting检测其在大肠杆菌中的表达情况。结果显示,NDV HN和GFP基因与表达载体pW425et正确重组。荧光显微镜下可见阳性重组菌落的绿色荧光,且该重组菌传代30代次以上,荧光效应依然稳定。SDS-PAGE显示表达出约63ku的条带,与已知表达的HN蛋白大小相符。Western-blotting进一步证实该蛋白能被NDV阳性血清所识别,具有反应原性。构建了GFP标记的重组NDV HN基因乳酸菌穿梭表达载体且能在大肠杆菌中表达。     

用反转录─聚合酶链反应快速鉴别新城疫病毒

根据新城疫病毒基因结构特点及强、弱毒株Ｆ０ 裂解位点的序列差异设计２ 对引物，建立了快速诊断新城疫并能鉴别诊断新城疫强、弱毒株的反转录聚合酶链反应（ ＲＴＰＣＲ） 技术。试验表明，该方法具有快速特异和操作简便等特点，不仅适用于对鸡胚毒的检测，也适用于对病鸡组织匀浆液的检测，是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒(NDV)基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示,强毒株可以扩增出442 bp的特异性片段和671 bp的通用片段,弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671 bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR,整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定,该方法最低能检测到100 pg的NDV RNA。     

重组鸡白细胞介素6对不同种类疫苗的免疫增强作用

为评价重组鸡白细胞介素6(rChIL-6)在商品鸡体内对不同种类疫苗的免疫增强作用,采用不同接种方式,应用rChIL-6分别对不同种类新城疫病毒(NDV)单联疫苗和新城疫病毒-传染性支气管炎病毒-禽流感病毒H9亚型三联疫苗(NDV-IBV-H9)进行了免疫增强试验以及传染性法氏囊病病毒(IBDV)单联油乳剂灭活疫苗的免疫增强田间试验,并进行了将rChIL-6与NDV Ⅳ系预混合乳化制备成的灭活疫苗的免疫试验.结果表明,将rChIL-6与NDVⅣ系、Ⅰ系活疫苗预混合后分别采用滴鼻点眼、肌肉注射接种方式的免疫增强效果优于其他方式;rChIL-6与NDV抗原预混后制备成油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于将相同抗原量的NDV油乳剂灭活疫苗和rChIL-6同时分点免疫接种.rChIL-6对NDV油乳剂灭活疫苗的免疫增强效果优于活疫苗,对NDV单联灭活疫苗的免疫增强效果优于NDV-IBV-H9三联灭活疫苗.田间试验表明,rChIL-6对IBDV油乳剂灭活疫苗首免和二免都具有显著的免疫增强作用,二免的免疫增强效果优于首免.这些研究结果为进一步开展新型鸡基因工程免疫增强剂研究奠定了基础.     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株L基因的同源性为 99.0 % ,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。     

鸭源新城疫强毒株对番鸭细胞因子及Toll样受体mRNA表达的影响

为研究人工感染鸭源新城疫强毒株(Md/CH/LGD/1/2005)诱导番鸭细胞因子及Toll样受体基因的表达情况,选用80只15日龄SPF番鸭,随机分为攻毒组和对照组,每组各40只,攻毒组以滴鼻点眼的方式接种1×107.0EID50鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)Md/CH/LGD/1/2005,对照组接种灭菌的磷酸盐缓冲液。分别在攻毒后36 h、72 h、7 d和25 d剖杀10只番鸭,采集每只番鸭的骨髓、脾、盲肠扁桃体、哈德氏腺和法氏囊样品,通过Real-time RT-PCR方法检测组织中NDV载量、细胞因子和Toll样受体基因的表达。结果显示,除哈德氏腺外,其余各组织中病毒含量在攻毒后72 h达到最高,对照组各组织中均未检测到病毒含量。与对照组相比,经NDV感染后,IL-1β在攻毒36 h的法氏囊和攻毒7 d的哈德氏腺中表达量显著上调(P<0.05);IL-2、IL-6、IL-18和IL-20在攻毒7 d的脾内表达显著上调(P<0.05)。TLR3、TLR15和TLR21均在法氏囊内高表达(P<0.05),且表达趋势相同,对NDV感染的应答可能具有协同效应。TLR5在骨髓、脾、盲肠扁桃体和法氏囊内显著上调(P<0.05);TLR7在攻毒7 d的骨髓和法氏囊内表达上调(P<0.05)。结果表明,感染NDV后番鸭可能通过TLR相关的信号转导通路诱导宿主免疫抗性基因的表达,调控机体的抗病毒免疫应答反应。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

新城疫病毒F基因与传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒免疫保护产生时间的测定

为了检测表达鸡传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒(rFPV gB F)的免疫产生期,将60只30日龄SPF鸡随机分为6组,以5d为间隔在试验开始第0、5、10、15、20d时选取10只进行免疫,经翅内侧皮下注射接种1000PFUrFPV gB F,另外的10只作为对照。在第1组免疫后的第25d,将不同日龄免疫组和对照组试验鸡再随机分为2组,分别用传染性喉气管炎病毒WG株和新城疫病毒F48E9株强毒攻击。结果表明,在rFPV gB F免疫接种后第10d时,可以诱发抗gB的抗体,保护免疫鸡抵抗传染性喉气管炎病毒WG株强毒和新城疫强毒的攻击。由此确定,rFPV gB F免疫产生的时间是接种后第10d。