多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒(NDV)基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示,强毒株可以扩增出442 bp的特异性片段和671 bp的通用片段,弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671 bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR,整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定,该方法最低能检测到100 pg的NDV RNA。     

牛病毒性腹泻病毒三种核酸检测方法的比较

利用针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的常规RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)和RT-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)3种核酸检测方法对不同质粒浓度的样品和417份临床疑似样品进行了检测,以比较3种核酸检测方法的优越性。结果显示,3种核酸检测方法中,real-time RT-PCR和RT-LAMP一样敏感,均能检测到10拷贝/μL,常规RT-PCR只能检测到1×104拷贝/μL,但临床样品检测表明,常规RT-PCR方法敏感度低,会造成一部分漏检,RT-LAMP灵敏度高又会造成错检。综合比较3种方法后,推荐用RT-LAMP结合real-time RT-PCR,不仅节约成本,且结果更为准确可靠,可提高牛病毒性腹泻的检出率。     

血清4型禽腺病毒夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种血清4型禽腺病毒（FAd V-4）夹心ELISA快速检测方法,本研究以FAdV-4多抗作为捕获抗体,FAdV-4 Penton蛋白单克隆抗体作为检测抗体,通过优化反应条件,建立了检测FAdV-4的夹心ELISA方法,对其进行特异性、敏感性、重复性检验和临床样品检测。方阵试验结果显示,FAdV-4多抗最佳稀释度为1∶2 000,单抗最佳稀释度为1∶32 000。该方法可特异性检测近年流行的高致病性FAdV-4毒株,而对之前的FAdV-4、其他血清型FAdV和常见禽病病原体不发生交叉反应。敏感性结果显示,该法对9.7×102TCID50/m L FAdV-4仍可检出。重复性结果显示,批内和批间试验的变异系数均小于5.0%。用建立的夹心ELISA方法与荧光PCR同时对100份肛口拭子样品进行检测,两者检测结果相符。上述结果表明,本研究建立的夹心ELISA检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于FAdV-4的大批量检测。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌二重实时荧光PCR检测方法的建立

根据结核分枝杆菌23SrRNA基因序列和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计了2对针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法特异性好,能区分不同模板浓度组合的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;可检测到10copies模板的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;对保存的50份PPD检测阳性牛的鼻黏液、牛乳和淋巴结进行检测,结果6份结核分枝杆菌阳性,1份牛分枝杆菌阳性,其余均为阴性,与PCR的检测结果一致。由此可见,建立的二重实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、可定量检测等优点,适合用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。     

应用聚合酶链反应检测鸡毒霉形体和滑液霉形体的研究

利用鸡毒霉形体（ＭＧ）与滑液霉形体（ＭＳ）基因一定区域互补的序列,合成能分别针对ＭＧ和ＭＳ目的基因的２对引物。用这２对引物对１０个国际标准的ＭＧ与ＭＳ菌株ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增,结果均得到与预期大小相一致的约７３２ｂｐ（ＭＧ）和２０７ｂｐ（ＭＳ）的ＰＣＲ产物。特异性试验结果表明,这２对引物对其它９种禽病病原ＤＮＡ或ＲＮＡ模板扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,ＭＧＰＣＲ能检出１００ｆｇ的ＭＧＤＮＡ,ＭＳＰＣＲ检出量为１０ｆｇ的ＭＳＤＮＡ。     

手工乳化制备新城疫油乳剂苗的试验

用手工和机械乳化制备10组不同HLB值的新城疫油乳剂苗,分别免疫3月龄来航鸡,免疫后每隔1-2周采血检测血清HI抗体,直至第8周.结果,相同HLB值的手工和机械乳化的油乳剂苗的HI抗体效价无明显差异;攻毒保护试验表明两种方法乳化的油乳剂苗免疫鸡均能获得保护,而对照鸡全部死亡.多数手工乳化的油乳剂苗在37℃环境放置30 d物理性状稳定.     

PCR-RFLP技术对Ⅰ群禽腺病毒12个血清型毒株的分型鉴定

应用扩增Ⅰ群禽腺病毒(AAV)Hexon基因A片段和B片段的2对引物,对Ⅰ群AAV的12个血清型毒株进行了PCR扩增.结果扩增出的A片段大小为1 219 bp,B片段大小为1 350 bp.对A片段用限制性内切酶HaeⅡ进行酶切,结果得到6种不同的RFLP图谱;对B片段进行HaeⅡ酶切,结果得到9种不同的RFLP图谱.综合分析A片段和B片段的PCR-RFLP结果,能鉴别Ⅰ群AAV的12个血清型.结果表明,建立的PCR-RFLP具有快速、简单、特异、灵敏等优点,可作为Ⅰ群AAV流行毒株血清型的快速分型工具.     

三种贝类原虫多重PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫、派琴虫和马尔太虫的基因序列,分别设计了3对特异性引物,通过对多重PCR扩增条件的优化,建立了可同时检测鉴别这3种原虫的多重PCR方法.用该技术对同一样品中的单孢子虫、派琴虫和马尔太虫模板进行扩增,结果均同时得到3条大小与试验设计相符的244 bp(单孢子虫)、596 bp(派琴虫)和478 bp(马尔太虫)的特异性扩增带,对其他贝类病原核酸的扩增结果为阴性.敏感性试验结果表明,该技术最低能检测到10 pg的单孢子虫、派琴虫和马尔太虫DNA,提示该技术适用于这3种原虫的临床快速检测和鉴别诊断.     

应用三重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡3种病毒性呼吸道传染病的研究

根据鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因文库,设计了3对分别与NDV、IBV和ILTV某段基因序列互补的引物.用这3对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV核酸模板进行三重PCR扩增,结果均同时得到了3条与设计相符的310 bp(NDV)、1720 bp(IBV)和647 bp(ILTV)三重PCR扩增带,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该三重PCR技术能检出10pg的IBV、1pg的NDV RNA模板和10 pg的ILTV DNA模板.     

牛轮状病毒VP7基因在昆虫细胞中的表达

利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamHⅠ+PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建了重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素筛选和PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-VP7。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,成功扩增了VP7基因,大小为981bp,所表达的重组蛋白大小为40.4ku,与预期值相符,该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛轮状病毒ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。