赤羽病病毒核衣壳蛋白基因的表达纯化及活性鉴定

为获得赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)核衣壳蛋白重组抗原,经RT-PCR扩增了OBE-1株的S节段,将其插入到pMD 18-T载体,然后用带有酶切位点的引物从该重组载体亚克隆出表达核衣壳蛋白的N基因,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后与同样处理的表达载体pET-28a( )进行连接,转化感受态细胞BL21(DE3)。将筛选出的阳性克隆进行测序、IPTG诱导表达和融合蛋白纯化及活性鉴定。结果表明,N基因含有1个全长702 bp的ORF,编码233个氨基酸,通过SDS-PAGE和Western-blotting分析,证实重组菌株可高效表达有免疫活性的分子质量约27 ku的可溶性融合蛋白,用薄层扫描仪分析,其最高表达量占可溶性菌体蛋白总量的58.5%。工程菌经超声波裂解高速离心后,上清液在ProBondTMPurification System(含Ni2 )天然状态下纯化,可获得高纯度的融合蛋白。     

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His Mut 表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。     

鸡抗病毒Mx基因的克隆与序列分析

用干扰素诱导剂poly(I)/(C)诱导鸡胚成纤维细胞,提取细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增了北京白鸡Mx基因全长编码区序列.序列分析表明该基因编码区长2118 bp,编码705个氨基酸残基,其第631位为天冬酰胺,理论上推测具有抗病毒活性.通过与GenBank中已登录的7个品系鸡Mx基因进行核苷酸系统进化树分析,结果显示,北京白鸡Mx基因与WL-N品系鸡Mx基因的亲缘关系最近.北京白鸡Mx基因序列与其他动物Mx基因序列的比较结果显示,核苷酸同源性为49.5%～76.8%,氨基酸同源性为44.1%～61.6%.据此可以推断克隆的Mx基因具有抗病毒活性的分子特征和特征性功能结构,不同种属动物Mx基因的同源性与其亲缘关系呈正相关.     

H9亚型禽流感病毒分离株A/Chick/Shandong/6/96的基因序列分析

对1株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)A/Chick/Shndong/6/96(H9N2)进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因的核苷酸序列皆与1994年分离株A/Chicken/Beijing/l/94(H9N2)具有很高的同源性(96.0%-98.6%);推导其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为A-R-S-S-R,完全符合H9 AIV欧亚分支中的类A/chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;虽然其神经氨酸酶(NA)基因与A/Chicken/Beijing/l/94(H9N2)相比,出现了9个核苷酸的缺失,然而其同源性仍然较高,为97.3%;而与欧亚分支中的类A/Chicken/Korea/323/96和类A/Quail/HongKong/G1/97亚分支的同源性却相对较低,分别为92.0%和84.2%;其它基因的比较情况也大体相近.提示该毒株是由1994年分离株进化而来,在遗传演化上属于H9亚型流感病毒欧亚分支中的类A/Chicken/Beiing/l/94(H9N2)亚分支.     

利用重组慢病毒载体共表达Cas9-sgRNA构建TLR4基因敲除DF1细胞系

Toll样受体4(TLR4)是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖(LPS)和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染禽DF1细胞。流式细胞仪分选、测序验证了在家禽DF1细胞系成功敲除了TLR4基因。然后利用GV393慢病毒表达载体,构建了CAG启动子启动Cas9的共表达载体Lv-CAG-Cas9-U6-sg RNA。通过转染、流式分选、培养单细胞克隆、靶基因组测序以及Western-blot检测,筛选获得1株TLR4基因敲除的DF1细胞系。结果表明,TLR4基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。本研究验证了共表达Cas9和sg RNA可以在禽源细胞系实现基因编辑,为利用重组慢病毒共表达Cas9和sg RNA策略探索构建敲除鸡模型研究奠定了理论基础和科学依据,也为研究禽TLR4基因功能、家禽天然免疫应答机制提供了细胞模型。     

一切为了人民,为了人民的一切——谈对"立党为公,执政为民"的认识

在中共中央政治局24日下午进行第十九次集体学习时,中共中央总书记胡锦涛强调:"加强党的先进性建设,提高党的执政能力,最终要落实到实现好、维护好、发展好最广大人民的根本利益上来.这是衡量党的一切工作是非得失的根本标准,也是衡量党的先进性的根本标准."他还说"我们党要始终保持先进性,就必须顺应时代的发展和人民的要求",因此"要坚持立党为公,执政为民","大兴求真务实之风,始终保持同人民群众的血肉联系",对此,每一个党员都应牢记心中.     

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达

参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物.通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/Ⅴ结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS.SDS-PAGE分析表明,经用0.1 mmol/L IPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52 ku的目的蛋白条带.Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性.     

赤羽病病毒核衣壳蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的重组赤羽病病毒核衣壳蛋白作为诊断抗原,建立了检测牛血清特异性核衣壳蛋白抗体的间接ELISA方法,初步组装成便于现地使用的试剂盒。经对试验条件进行优化,确定最佳抗原包被量为每孔1μg(100μL),样品稀释度为1∶100,兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶8 000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。应用初步研制的间接ELISA试剂盒和微量中和试验法分别对云南省的89份、内蒙古的100份牛血清样本进行了检测,以中和试验为参照,经统计学处理,得出检测临界值分别为0.411和0.303,2种方法的符合率分别为72.7%(56/77)和91.4%(85/93)。试剂盒在37℃保存3 d,对敏感性无明显影响。