禽流感病毒GD/1/96株M基因在sf9昆虫细胞中的表达

从pUCM 1质粒中亚克隆禽流感病毒M基因至转移载体 pFastBac1质粒 ,PCR鉴定后 ,转化DH10 BAC感受态细胞。提取重组杆粒rBacM ,以M 13为通用引物作PCR分析 ,证明M基因已转入其中。用CellFectin试剂包裹rBacM杆粒转染sf9细胞 ,96h收取感染细胞。细胞表达产物裂解后作SDS PAGE蛋白电泳和Westernblot分析 ,证明M基因在昆虫细胞中成功表达且具有与天然M 1蛋白相似的活性。琼脂扩散试验结果进一步证明 ,重组M 1蛋白可作为诊断抗原。     

日本血吸虫DNA疫苗对黄牛的田间免疫试验

用VRSj2 8、VRSj2 3和VRSj2 8+VRSj2 3对黄牛免疫后 ,在日本血吸虫病流行区云南省洱源县进行日本血吸虫田间自然攻击 5 4d ,免疫牛的减成虫率为 3 3 .0 %～ 44 .0 % (P <0 .0 5 ) ,粪便和肝组织的减卵率较高 ,特异性IgG在首次免疫后显著增高。提示 ,用此类疫苗对牛进行大规模免疫预防 ,可减少人群感染的机会。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因真核表达载体的构建

应用限制性内切酶BamHⅠ将片段ompH从重组质粒pMDT-omp H切下,非定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定,证实成功构建了禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因的重组真核表达质粒pcDNA3-ompH。将重组表达质粒转染至 COS7 细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及Western-blotting检测,证明了外膜蛋白H基因获得了瞬时表达。     

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒 (AIV)NA基因 ,克隆入 pMD18 T载体中 ,再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)表达载体pPIC9k中 ,构建了重组转移载体 pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GS115和筛选高拷贝重组转化子及筛选His Mut 表型转化子后 ,摇瓶培养 ,10mL/L甲醇诱导表达后 ,经SDS PAGE、Western blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明 ,获得了几株高效表达重组表达株 ,并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。     

禽大肠埃希氏菌O78和巴氏杆菌(5∶A)外膜蛋白的免疫研究

用超声裂解、Sarkosyl处理和超速离心法提取禽大肠埃希氏菌O78强毒株 (简称O78)、O78耐氯霉素弱毒株 (简称O78r)、禽多杀性巴氏杆菌 5∶A强毒株C4 8 1(简称C4 8 1)、O78r 与C4 8 1的融合双价弱毒株F4 (简称F4 )菌体外膜蛋白 (OMP)。经SDS PAGE结果显示 ,O78、O78r、C4 8 1与F4 均有 1条分子质量为 31.0～ 4 3.0ku ,分子质量相近的OMP条带 ;O78与C4 8 1还有 1条分子质量小于31.0ku且相近的OMP条带。用OMP制备的油乳剂疫苗分别免疫小白鼠 15d和岭南黄鸡后 2 2d ,以O78、C4 8 1强毒菌攻击 ,结果表明O78、C4 8 1的OMP不但对同源菌具有免疫作用 ,且具有交叉免疫保护作用 ;用各自的OMP作包被抗原 ,建立的ELISA方法也能交叉检测到 3组OMP免疫鸡产生的抗 2种菌OMP的IgG抗体。     

日本血吸虫抱雌沟蛋白DNA疫苗的研究

为构建含日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)完整ORF的核酸疫苗,评估该核酸疫苗在小鼠体内诱导抗血吸虫感染的免疫保护效果及其保护机制,将编码日本血吸虫大陆株抱雌沟蛋白基因ORF片段克隆到真核表达载体pVAX1中,用重组质粒pVAX1-SjGCP三次肌肉注射BALB/c小鼠,攻击感染血吸虫尾蚴,攻击感染后第42天剖杀小鼠冲虫,计算减虫率及肝和粪便的减卵率,评估其免疫保护效果。用流式细胞术(FCM)检测第3次免疫后小鼠淋巴细胞亚群CD4+、CD8+占总淋巴细胞的百分比及细胞因子IL-4、IFN-γ表达水平,探讨核酸疫苗的免疫机制。结果显示,小鼠经pVAX1-SjGCP质粒免疫后诱导了31.9%的减虫率,以及47.85%、68.04%的肝减卵率和粪便减卵率,与PBS组差异显著;pVAX1-SjGCP免疫组淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分比增加,细胞因子IFN-γ及特异性IgG水平提高,与pVAX1组差异显著。结果表明,血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗能够诱导宿主细胞免疫和体液免疫应答,产生Th1/Th2型混合的细胞免疫反应,具有一定的抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果分析

为探讨禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因单价DNA疫苗及融合DNA疫苗的免疫效果,利用PCR技术扩增了禽多杀性巴氏杆菌omph和ompa基因片段,并克隆入pcDNA3.1(+),构建了DNA疫苗pcDNA-OMPH(pOMPH)、pcDNA-OMPA(pOMPA)和pcDNA-OMPH/OMPA(pOMPHA),将其体外转染SP2/0细胞,用间接免疫荧光试验检测其表达情况。同时以弱毒活疫苗作为阳性对照,pcDNA3.1(+)和PBS作为阴性对照,分别免疫4周龄鸡,检测血清特异性抗体水平、外周血淋巴细胞增殖情况和IFN-γ分泌情况,经强毒攻击后计算各疫苗的保护率。结果显示,融合DNA疫苗组血清抗体水平与弱毒活疫苗相当,明显高于单价DNA疫苗(P<0.05);pOMPHA组的刺激值(SI值)和IFN-γ分泌水平显著高于其他各组(P<0.05),单价DNA疫苗组略高于弱毒活疫苗组;强毒攻击后各DNA疫苗均可为动物提供一定的保护力,其中融合DNA疫苗的保护率最高,可达86.7%,其次为弱毒活疫苗,为73.3%,而单价DNA疫苗则低于弱毒活疫苗,仅为60%和66.7%。结果表明,DNA疫苗尤其是融合DNA疫苗在预防禽多杀性巴氏杆菌病(禽霍乱)方面具有较好的应用前景。     

J亚群禽白血病病毒的LTR体外启动活性分析

为分析J亚群禽白血病病毒LTR基因的体外启动活性,将其克隆至含有萤光素酶报告基因的pGL3栽体中,构建了LTR重组质粒及其缺失不同区段的重组质粒,转染DF-1细胞测定萤光素酶的表达情况.结果显示,缺失U3时萤光素酶的表达量明显降低,缺失U5时萤光素酶的表达反而上升,这表明U3区可能具有强启动子功能,而U5区可能具有负调...     

稳定表达甲型流感病毒M1蛋白的MDCK细胞系的建立

为建立稳定表达流感病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8)株M1蛋白的MDCK细胞系,将流感病毒PR8株M基因28～1 009bp序列插入逆转录病毒载体pMX,构建了重组质粒pMX-PR8M,并与pCI-NF-KB、pMDSV和MDSV质粒共转染293T细胞,制备逆转录病毒样颗粒。利用逆转录病毒样颗粒感染MD-CK细胞,经嘌呤霉素筛选获得具有抗性的细胞克隆,通过PCR、RT-PCR和间接免疫荧光试验筛选的鉴定方法。获得1株稳定表达M1蛋白的MDCK细胞系,命名为MDCK-PR8M1。本研究建立的表达M1蛋白的细胞系,为研究流感病毒M1蛋白生物学功能以及扩增含有外源基因的流感病毒提供了有利的工具。     

美国疫苗伤害补偿计划及其对我国的启示

上世纪80年代,美国为了应对疫苗供应危机,颁布了《国家儿童疫苗伤害法》,1988年开始实行疫苗伤害补偿计划,经过几年的努力,初步实现了国会的双重立法目标。我国应借鉴美国的经验,明确立法目标,由国家制定统一的补偿标准,不断扩大补偿范围,制定更具操作性的规定,进一步完善我国的疫苗伤害补偿制度。