猪传染性胃肠炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的构建及其免疫效力

利用DNA重组技术,将编码猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株的全长S基因和主要抗原位点的Sa片段分别插入真核表达载体pCI的多克隆位点中。应用酶切、PCR方法鉴定阳性重组子pCI-Sa和pCI-S。将昆明鼠随机分成A、B、C 3组(A组为pCI-Sa免疫组、B组为pCI-S免疫组、C组为pCI载体对照组),每组35只,每只鼠肌肉注射100μg,免疫3次,每次间隔2周。于初次免疫后第0、14、21、28、354、2 d采血,用ELISA检测血清抗体动态变化,流式细胞仪检测外周血CD4 和CD8 T细胞数量变化。结果表明,重组真核表达载体均能诱导免疫鼠产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,而且pCI-Sa的免疫效果优于pCI-S。     

猪传染性胃肠炎病毒国内分离株S基因克隆及与国外分离株的同源性比较

用猪睾丸细胞增殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)国内分离株TH 98,根据基因库中已发表的TGEVS基因cDNA序列 ,利用Oligo软件设计并合成 2对引物 ,进行逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) ,扩增出 2 .3kb和 2 .1kb2个片段 ,即Sa与Sb。将Sa与Sb先后插入到pUC18质粒载体上的EcoRⅠ和PstⅠ多克隆位点上 ,构建了重组质粒pUC S。根据TGEVS基因位点和 pUC18的物理图谱 ,用相应的限制性内切酶进行酶切及套式PCR方法鉴定、分析 ,证明克隆的pUC S为TGEVS基因。同时对pUC S进行序列测定分析 ,并与来自美国、英国和日本的 5个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较 ,证明了S基因的高度保守性     

猪氨肽酶N多抗血清的制备及活性分析

为进一步研究猪氨肽酶N(pAPN)介导TGEV与靶细胞相互作用的机制,将编码猪氨肽酶N成熟肽基因(105～2889bp)克隆至原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-30a-pAPN转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,利用蛋白切胶纯化技术对目的蛋白进行纯化,制备其多抗血清,并通过琼扩试验、Western-blot分析、病毒抑制试验及体外瞬时转染试验分析该多抗血清的生物活性。结果,获得了大小为112ku的目的蛋白,多抗血清效价为1∶32,该血清在低浓度时仍具有抑制病毒的活性。结果证实,制备的多抗血清具有较高的抗体效价、较强的特异性及良好的生物活性。     

产气荚膜梭菌plc基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western-blot方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导4～5h后重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为66ku。用间接ELISA方法检测的多抗血清效价达到1∶65 536。Western-blot结果证实,重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的反应原性,而且多抗血清能够检测产气荚膜梭菌分泌的天然α毒素蛋白。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。