猪传染性胃肠炎病毒国内分离株S基因克隆及与国外分离株的同源性比较

用猪睾丸细胞增殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)国内分离株TH 98,根据基因库中已发表的TGEVS基因cDNA序列 ,利用Oligo软件设计并合成 2对引物 ,进行逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) ,扩增出 2 .3kb和 2 .1kb2个片段 ,即Sa与Sb。将Sa与Sb先后插入到pUC18质粒载体上的EcoRⅠ和PstⅠ多克隆位点上 ,构建了重组质粒pUC S。根据TGEVS基因位点和 pUC18的物理图谱 ,用相应的限制性内切酶进行酶切及套式PCR方法鉴定、分析 ,证明克隆的pUC S为TGEVS基因。同时对pUC S进行序列测定分析 ,并与来自美国、英国和日本的 5个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较 ,证明了S基因的高度保守性     

猪氨肽酶N多抗血清的制备及活性分析

为进一步研究猪氨肽酶N(pAPN)介导TGEV与靶细胞相互作用的机制,将编码猪氨肽酶N成熟肽基因(105～2889bp)克隆至原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-30a-pAPN转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,利用蛋白切胶纯化技术对目的蛋白进行纯化,制备其多抗血清,并通过琼扩试验、Western-blot分析、病毒抑制试验及体外瞬时转染试验分析该多抗血清的生物活性。结果,获得了大小为112ku的目的蛋白,多抗血清效价为1∶32,该血清在低浓度时仍具有抑制病毒的活性。结果证实,制备的多抗血清具有较高的抗体效价、较强的特异性及良好的生物活性。     

肠出血性大肠杆菌VT1B亚单位的重组表达及其单克隆抗体的制备

为制备抗肠出血性大肠杆菌(EHEC)VT1B亚单位的单克隆抗体(McAb),以大肠杆菌EDL933的基因组DNA为模板扩增VT1B基因,纯化后经BamHⅠ和XhoⅠ酶切,连入表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-VT1B,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,实现了融合蛋白的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的27%。重组蛋白纯化后,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,获得3株融合细胞1G11、2H8、1B10,Western-blotting表明,此3株单抗能与VT1B蛋白特异性结合而与载体蛋白不反应。Ig亚类分别为IgG1、IgG2a和IgG2b,染色体数均大于100,腹水单抗ELISA抗体效价大于1∶256000,亲和常数分别为0.54×108M-1、0.95×108M-1、0.33×107M-1,间接ELISA叠加试验初步鉴定结果表明,这3株单抗针对的是同一抗原表位。此3株特异性单抗的获得为VT1毒素的检测奠定了基础。     

产气荚膜梭菌plc基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增编码产气荚膜梭菌α毒素去除信号肽的plc基因片段,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建重组质粒pGEX-plc,经双酶切和测序鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,表达产物经切胶纯化后作为免疫原制备多克隆抗体,应用间接ELISA和Western-blot方法对所得抗体进行检测。结果显示,经1.0mmol/L IPTG诱导4～5h后重组蛋白表达量最高,并且主要以包涵体的形式存在,分子质量为66ku。用间接ELISA方法检测的多抗血清效价达到1∶65 536。Western-blot结果证实,重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合,具有良好的反应原性,而且多抗血清能够检测产气荚膜梭菌分泌的天然α毒素蛋白。上述结果表明,此多克隆抗体能够应用于临床诊断。