猪传染性胃肠炎病毒核衣壳N蛋白基因的克隆与鉴定

根据文献已发表的猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)cDNA基因序列 ,设计和合成 1对引物 ,以TGEVTH 98强毒株基因组mRNA为模板 ,通过RTPCR技术扩增其N基因 ;将RTPCR产物按正确的阅读框架 (ORF)定向克隆到载体pProEXHTb上 ,重组质粒PHN转化进大肠埃希氏菌DH5α株 ,通过酶切分析及序列测定表明已成功获得了TGEVN基因的无性繁殖体系。TH 98强毒株的N基因与Purdue 115株、FS772 / 70株、TO14株、96193 3株及TFⅠ株的核苷酸序列的同源性分别为 99%、97%、97%、95 %和 96% ,氨基酸序列的同源性分别为 99%、97%、98%、96%和 97%。     

猪传染性胃肠炎病毒重组核蛋白的纯化与Dot-ELISA抗体检测方法的建立

将重组猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)N基因原核表达载体pProEXHTb转化的大肠埃希氏菌 ,用IPTG诱导表达核蛋白 ,经过Ni NTA柱的纯化 ,获得纯化核蛋白。以该蛋白制备抗原 ,建立了以TGEVN蛋白重组抗原的Dot ELISA诊断技术 ,其抗原最适包被量为 1μg ,抗原预点膜在 4℃可保存 5周以上。本法快速简便 ,适合基层进行抗体检测     

猪流行性腹泻病毒S基因片段的原核表达及其表达产物的反应原性

为了筛选反应原性较好的猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因片段,利用生物学软件对PEDV S基因进行了抗原位点分析,在不破坏线性抗原位点的前提下将S基因分为连续的4段进行表达,Western-blot检测表明,S1、Ps420、S2、S3蛋白都有很好的抗原性.纯化这4种蛋白,并免疫家兔,分别制备了S1、Ps420、S2、S3抗血清,间接ELISA检测结果显示,这4种抗血清都能识别细胞培养的PEDV,其中S1抗血清的反应性最好,其P/N值达到8.01,其次为Ps420抗血清.免疫荧光试验表明,S1、Ps420抗血清能识别天然的PEDV病毒粒子.提示,S1、Ps420抗血清在病原检测诊断中有一定的潜在应用价值.     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白D位点单克隆抗体的制备和鉴定

通过大肠杆菌表达了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的D位点,并以D位点的六聚体作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法进行克隆。结果显示,得到3株能稳定分泌抗TGEV S蛋白D位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2C104、5E1012和4B101,其中2C104和5E1012分泌抗体类型是IgM亚类,4B101为IgG1亚类。2C104、5E1012、4B101三株杂交瘤细胞培养上清液的间接ELISA抗体效价分别为1∶128、1∶128、1∶64,腹水效价分别为1∶103、1∶104、1∶4×103。间接免疫荧光鉴定结果表明,3株细胞均能和TGEV发生特异性反应,且在连续传代和冻存后仍能稳定分泌抗体。本研究针对S蛋白D位点制备了单克隆抗体,为传染性胃肠炎的诊断和TGEV与宿主互作机制的研究奠定了基础。     

牛轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立检测牛轮状病毒(BRV)的双抗体夹心ELISA方法,本研究制备了家兔抗牛轮状病毒VP6蛋白的多克隆抗体,并以VP6蛋白为免疫原通过细胞融合和筛选获得了5株分泌抗BRV VP6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为5C9、3G10、6E11、4D10和5A3。Western-blot和间接免疫荧光试验结果均表明,5株单抗与BRV具有良好的亲和性。以纯化的家兔抗BRV VP6蛋白多抗为捕获抗体,以4D10单抗为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。敏感性试验表明,该方法对BRV的最低检出量(TCID50)为9.884×104/m L。特异性试验结果表明,与PRV、PEDV、BPV及TGEV均无交叉反应。板间和板内重复性试验结果显示,该方法具有良好的重复性。对95份临床样品进行检测,与RT-PCR方法比较,符合率为100%。综上,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于BRV的快速检测。     

猪传染性胃肠炎病毒核酸免疫昆明鼠的抗体应答

以猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)TH98株N基因的重组质粒 pHN为模板 ,Li 15和Li 2为上、下游引物扩增出TGEVTH98/N基因。将N基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)分别用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后连接 ,构建了重组真核表达载体 pcDNA N。将昆明鼠随机分为 2组 ,分别肌肉注射 pcDNA N和pcDNA3.1(+) ,每只鼠 10 0 μg ,共免疫 3次 ,每次间隔 2周。首次免疫后第 0、14、2 1、2 8、35、39、4 7和 5 4d采血分离血清 ,采用ELISA检测抗体动态变化。注射pcDNA N组小鼠在首次免疫后第 39d检测到针对TGEVN蛋白的阳性抗体。     

表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究猪流行性腹泻病毒中和抗原位点(COE)基因在乳酸菌中的表达情况,进而探讨重组乳酸菌的免疫原性。将COE基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG-1中,构建重组表达载体pPG-1-COE,并将其电转化入干酪乳杆菌Lactobacilluscasei393中,应用Western-blotting、间接免疫荧光染色和全细胞ELISA检测重组蛋白的表达情况,用重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠,测定免疫应答水平。结果表明,COE可在构建的重组干酪乳杆菌表达系统中表达,目的蛋白定位于细胞表面。在免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA(P0.01);血清具有中和活性(1∶12);脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,IL-4和IFN-γ水平显著提高(P0.01)。证实,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生对猪流行性腹泻病毒特异的黏膜免疫应答和系统免疫应答。     

猪轮状病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的猪轮状病毒VP6蛋白作为检测抗原,建立检测猪轮状病毒血清抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被量为6μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的工作浓度为1∶5 000。应用该方法检测阴性血清样本30份,确定的检测临界值为0.143(D490nm≥0.143,则判定为阳性)。特异性试验表明,用建立的间接ELISA对传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒和伪狂犬病病毒阳性血清进行检测时无交叉反应。重复性试验证实,批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本研究建立的用以检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可应用于猪轮状病毒的病原学检测。