动物衣原体RPA检测方法的建立

为建立一种快速、准确的动物衣原体检测方法,本研究基于动物衣原体的保守基因env B的序列,设计并合成引物与探针,建立了一种动物衣原体特异性重组酶聚合酶扩增(RPA)检测方法。该检测方法在37~39℃恒温反应20 min,即可实现对动物衣原体目的基因片段的有效扩增,并具有高灵敏度的特点,最低检测限为101copies/L,同时利用建立的RPA检测方法和普通PCR方法对10份临床样品进行衣原体检测,结果阳性检出率完全一致。表明,本研究建立的动物衣原体RPA检测方法操作简单方便、灵敏度高,短时间内能获得准确可靠的诊断结果,对动物衣原体的临床检测和疾病诊断提供了一种新的、可靠的技术支持。     

产气荚膜梭菌α毒素和ε毒素的共表达及其免疫原性的研究

利用PCR技术从D型产气荚膜梭菌标准株C60-2基因组中扩增出α毒素基因CPA和ε毒素基因ETX。然后将CPA、ETX分别插到双表达载体pETDuet-1上,成功构建重组质粒pETDuet-1-CPAETX。将重组质粒pETDuet-1-CPA-ETX转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,菌体蛋白样品经SDS-PAGE分析,可见43ku和34ku两条特异性条带,表明插入基因得到了表达。Western-blot结果显示,共表达的α毒素和ε毒素蛋白均能与抗毒素抗体发生反应,具有很好的反应原性。用共表达的α、ε毒素蛋白免疫小鼠,可使其血清中产生较高浓度的中和抗体,且能抵抗D型产气荚膜梭菌培养液上清的攻击,免疫保护效果明显优于ε毒素蛋白单独免疫的保护效果。以上结果表明,本研究构建的产气荚膜梭菌α、ε毒素蛋白共表达体系可以用于D型产气荚膜梭菌毒素疫苗的制备,为预防多血清型病原的多价疫苗的研制提供了思路。