鹅细小病毒vp1基因的原核表达及抗原性分析

将鹅细小病毒(GPV)H1株vp1基因从pMD18T-vp1亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点,构建了原核表达载体pGEX-6P-vp1,将其转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了108ku的融合蛋白,该融合蛋白经亲和层析纯化并经Western-blot检测。结果表明,纯化的融合蛋白可与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

内含肽和麦芽糖结合蛋白介导具有抗病毒活性牛α干扰素的表达

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素(BoIFN-α)蛋白,在BoIFN-α基因的上游无缝连接内含肽Ssp DnaB intein(SDI)序列,然后克隆至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的表达载体pMAL-SDI-BoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,且产物主要以可溶形式存在。经直链淀粉树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经MDBK-BVDV(牛病毒性腹泻病毒)干扰素活性系统检测,证实干扰素融合蛋白具有抗病毒活性。     

禽流感病毒NS1抗体间接阻断ELISA检测方法的建立

以禽流感病毒(AIV)重组NS1蛋白作为检测抗原,兔抗NS1血清为阻断抗体,建立了检测AIVNS1抗体的间接阻断ELISA方法.经筛选确定,抗原的最佳包被浓度为0.6 tμg/mL,阻断抗体的最佳稀释度为1:10 000,待检血清最佳稀释度为1:10.用该方法对42份AIV感染禽类血清样本和50份用AIV灭活疫苗免疫的禽类血清样本进行检测,结果显示,该方法的敏感性为95.2%,特异性为90.0%.交叉反应试验证明,该方法与新城疫等8种其他禽病阳性血清不发生交叉反应.临床检测结果显示,185份AIV灭活疫苗免疫禽血清样本的阴性率为89.2%,20份基因工程疫苗免疫禽血清样本的阴性率为95.0%,42份健康非免疫禽血清样本的阴性率为100%.表明,建立的间接阻断ELISA方法可用于区分AIV自然感染禽和疫苗免疫禽.     

牛分枝杆菌CFP-10基因的原核表达及其表达产物的变态反应原性的鉴定

以牛分枝杆菌基因组为模板,PCR扩增获得CFP-10基因,并连入pET-32a(+)载体,获得了重组质粒pET-32a-CFP-10。将重组质粒转入宿主菌大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,重组蛋白rCFP-10以可溶形式表达并被纯化,将rCFP-10在致敏豚鼠皮内做迟发型变态反应(DTH)检测,并以PPD作为阳性对照。结果显示,测得rCFP-10组豚鼠皮肤红斑直径平均值为10mm,接近于PPD组(13mm)。结果证明,以pET-32a(+)为载体进行原核表达,获得的重组蛋白rCFP-10依然具有较强的迟发型变态反应原性,同时也证明了CFP-10具有作为皮试诊断试剂抗原的潜力,这一结果为牛结核病新型DTH皮试诊断的研究奠定了基础。     

牛源支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

从2008年黑龙江省某奶牛场犊牛中暴发的一种以呼吸道病变为主疾病的患病牛中分离出3株细菌,根据其形态特征、培养特性、生化特性等将分离菌鉴定为支气管败血波氏杆菌.对分离菌进行药敏试验、皮肤坏死试验及16 S rRNA基因的克隆和序列分析.结果显示,该菌对氟哌酸、丁胺卡那霉素、庆大霉素、氯霉素敏感,可导致豚鼠皮肤坏死;其16 S rRNA基因序列与GenBank中收录的标准菌株Bb RB50株(BX640449)同源性为100%.证实,引起该病的病原是支气管败血波氏杆菌.     

从“礼入于法”看中国古代法律

《四库全书提要》唐律疏议解云:“唐律一准于礼,得古今之平,故宋世多采用之,元时断狱亦每引为据。明洪武初命儒臣,同刑官进讲唐律,后命刘惟谦等详定明律,其篇目一准终于唐。”由此看,在中国古代法中,“一准于礼”原是一项传统。其实,这不但是唐以后历朝法律的特点,也是中国古代法的一大特色。 说“唐律一准于礼”只道出一件事实和一个结果,     

重组鹅IFN-α蛋白在内含肽-冷激诱导表达系统中的表达

为了在大肠杆菌系统中高效表达具有抗病毒活性的重组鹅IFN-α(GoIFN-α)蛋白,在GoIFN-α基因上游融合内含肽Ssp Dnabmini-intein(SDI)序列,然后克隆至pET-43.1a(+)载体中,再将获得的pET-43.1a(+)-SDI-GoIFN-α重组载体和pColdⅢ载体分别进行双酶切,构建内含肽-冷激表达载体pColdⅢ-Nu-sA-SDI-GoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG低温诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经CGBQ-GPMV系统检测,证实表达的融合蛋白具有生物学活性,为后续的纯化工作和研究具有天然活性的重组鹅IFN-α奠定了基础。     

牛IFN-γ单克隆抗体的制备及鉴定

为进一步研究牛IFN-γ(BoIFN-γ)单克隆抗体在牛免疫学以及牛疫病诊断中的应用,用原核表达的重组牛IFN-γ(rHis-BoIFN-γ)免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,免疫3次后取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。用建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经3～5次亚克隆,最终获得12株能稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株。Ig亚类鉴定结果显示这12株杂交瘤细胞均为IgG,其中5株为IgG1,3株为IgG2a,4株为IgG2b。这12株杂交瘤细胞在体外具有稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的能力。Western-blot及间接ELISA证明这12株单克隆抗体均可特异性地结合rBoIFN-γ蛋白。间接免疫荧光试验显示,这12株单抗均与真核细胞BHK-21表达的rBoIFN-γ产生荧光反应,证明这些单抗能够与接近天然的BoIFN-γ反应,证实了单抗的特异性。ELISA叠加试验表明,3C2与1H4、1G6与1G4针对不同表位,1A10、1B2、2B9、3C4四株和1C1与1G6、1G4与3C2、1A10与1G8针对相同或相近的表位。