实时荧光定量PCR检测硅藻UPA基因在溺死诊断中的研究

目的建立硅藻UPA条形码基因的实时荧光定量PCR检测方法,探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法对Gene Bank中登录的硅藻UPA基因序列进行比对获得同源序列,据其设计硅藻门通用引物。对2种人体常见共生菌(大肠杆菌、双歧杆菌)、3种浮游细菌、15种浮游藻类、32具尸体(其中生前溺水死亡28例,死后抛尸1例,陆地死亡3例)的组织样本(肺、肝、肾)及尸体发现地水样提取DNA,采用设计的引物进行特异性、灵敏度、重复性试验,分析检材中硅藻检出情况,统计硅藻阳性率,以上述组织样本的微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法检测结果对建立的q PCR检测方法进行比较评估,比较该方法与PCR-毛细管电泳检测法的灵敏度。结果引物UPA99仅对硅藻标准株(针杆藻、舟形藻、直链藻、小环藻、菱形藻)DNA具有扩增,扩增产物熔解曲线平稳,峰尖且窄,熔解温度为(87±1)℃。以p MD18-T重组质粒为标准品,检测区间为1.56×10~2-1.56×10^-5ng/μL,建立实时q PCR方法的灵敏度为1.56×10^-5ng/μL,而PCR-CE方法的灵敏度为1.56×10-3ng/μL。批间及批内变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性。对于生前溺水尸体肺、肝、肾的检出率依次为89.3%,71.4%,64.3%。结论基于硅藻UPA基因设计通用引物,建立的q PCR硅藻检验法特异性高、灵敏度高、重复性好,应用于溺死诊断具有较好的应用前景。