猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性

应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白Dnak C末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h.用BugBusterTM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性.     

猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定

以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别.以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠.筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11.Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应.抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF111分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链.相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位.