牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了检测牛传染性鼻气管炎病毒,本研究建立了牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。通过设计特异性引物扩增病毒基因,将扩增的目的片段(119 bp)连接到pMD19-T载体中,构建重组质粒。将重组质粒作为阳性标准品,用于SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立。结果显示,特异性引物扩增的目的片段约为119 bp,符合预期的大小,经测序鉴定所扩增的目的片段正确。敏感性结果显示,用该方法检测阳性质粒标准品的最低限度为3.04 X101 copies/mL,是Nano-PCR的10倍。将牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒3型与牛传染性鼻气管炎病毒进行特异性检测。结果显示,只有牛传染性鼻气管炎病毒被检测到,其他病毒均未有特异性的扩增曲线,表明该方法的特异性良好。批内和批间重复变异系数均小于1%,显示该方法具有良好的重复性。用建立的方法对20份疑似IBRV的临床样品进行检测,并与Nano-PCR检测方法进行对比,结果显示本方法的阳性样晶率高于Nano-PCR检测方法。本研究建立的牛传染性鼻气管炎病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法特异性好、灵敏度高、重复性好,可用于牛传染性鼻气管炎病毒的检测。     

牛病毒性腹泻病毒Nano-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分子检测方法,本研究利用金纳米颗粒材料与传统PCR技术相结合,针对BVDV 5′UTR保守序列设计引物,建立了BVDV Nano-PCR新型分子检测方法,并与RT-PCR及商品化IDEXX试剂盒BVDV抗原检测方法分别对临床样品进行对比研究。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR只对BVDV特异,而对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感3型病毒(BPIV3)均无交叉反应;Nano-PCR敏感性是普通PCR的10倍,最低核酸检测量为6.84×10~2copies/L。临床检测结果显示,建立的Nano-PCR方法对38份临床样品的阳性检出率为34.21%,是RT-PCR的2.6倍,是IDEXX试剂盒的1.5倍。本研究结果表明,建立的BVDV Nano-PCR方法可以用来对临床样品进行快速诊断和鉴定,具有特异性高、灵敏度好、快速稳定的优点。