豆状囊尾蚴外泌体的分离鉴定及其对家兔免疫应答的调节作用

为探究豆状囊尾蚴外泌体对家兔免疫应答的调节作用,以收集的豆状囊尾蚴分泌排泄产物(ESP)为材料,通过差速离心法分离外泌体,经透射电镜和Western-blot分别对其形态和标志分子进行鉴定。分别用外泌体和ESP免疫家兔,ELISA方法检测家兔血清中特异性抗体和血清细胞因子水平,并通过人工攻虫感染评价其免疫保护效果。结果显示,豆状囊尾蚴外泌体直径为30~150 nm,呈圆形或椭圆形,有完整的脂质双分子层膜结构,且含有外泌体标志蛋白CD63。而且,外泌体免疫组血清特异性抗体、IL-10和IL-4的水平显著升高(P<0.05),而IFN-γ和TNF-α显著降低(P<0.05)或差异不显著。经剖检发现,豆状囊尾蚴ESP免疫组和外泌体免疫组的减虫率分别为65.17%和24.88%。结果表明,外泌体通过上调宿主抑炎因子的表达,诱导宿主产生了Th2型细胞免疫应答,从而有利于囊尾蚴在宿主体内的存活。     

基于serpin重组蛋白的豆状囊尾蚴病间接ELISA诊断方法的初步建立

为检测兔豆状囊尾蚴(Cysticercus pisiformis)感染,利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)扩增豆状囊尾蚴serpin基因,并对其开放阅读框(ORF)及编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。构建p ET-30a(+)-Cpserpin重组表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。以纯化的重组蛋白(r Cpserpin)为包被抗原,优化反应条件,建立检测兔豆状囊尾蚴病血清抗体的间接ELISA方法。结果表明,Cpserpin基因的完整ORF长为1 149 bp,含有serpin家族保守基序(DEEGAE)、serpin标签序列(FKVDHPFIFFI)以及serpin特有的反应中心环结构域(RCL);r Cpserpin主要以包涵体形式表达,且能被家兔豆状囊尾蚴阳性血清所识别。所建立的间接ELISA的最佳反应条件包括:r Cpserpin包被质量浓度为2 g/m L,待检血清和酶标二抗的稀释度分别为1∶100和1∶2 500,包被液和封闭液分别为p H9.6碳酸盐缓冲液和10 g/L牛血清白蛋白。利用上述条件检测60份家兔豆状囊尾蚴阳性血清和108份阴性血清,证实该方法的临界值为0.368,敏感性和特异性分别为96.7%和93.5%。结果表明,基于Cpserpin重组蛋白的间接ELISA方法可用于家兔豆状囊尾蚴病的血清学诊断。