比格犬α7干扰素成熟肽基因的原核表达及表达产物活性的分析

从比格犬的脾中提取基因组DNA,采用RT-PCR方法扩增比格犬α7干扰素成熟肽基因。将纯化的PCR产物克隆至pMD19-T载体,转化入感受态细胞DH5α中,PCR检测及测序鉴定结果表明,克隆的目的基因为比格犬α7干扰素成熟肽,与GenBank中登录的犬干扰素序列(NM001006654)的同源性达到100%。在此基础上构建重组原核表达质粒pET-32a-CaIFN-α7,并转化至表达宿主BL21(DE3)中。该工程菌在37℃经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,结果在分子质量约38.4ku处出现了目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在。经Bandscan软件分析,表达产物约占菌体总蛋白的48.5%。用Protein Refolding Kit对包涵体进行纯化复性,重组CaIFN-α7在犬肾细胞(MDCK)上具有较高的抗病毒活性。     

比格犬β-防御素cBD1基因的原核表达与鉴定

为获得比格犬β-防御素cBD1基因的表达产物,根据GenBank中登录的犬β-防御素基因cBD1(canis familiarisβ-defensin-like peptide 1)的序列设计引物,提取比格犬睾丸组织总RNA,利用PCR扩增cBD1基因,然后将其克隆至pET-32a(+)载体,构建原核表达质粒pET-32a-cBD1,通过PCR、酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了约28ku的表达产物,与预期大小的β-防御素cBD1的分子质量相一致。Westernblot分析表明,表达产物与抗His标签鼠单克隆抗体发生反应,显示重组蛋白获得了表达。结果表明,成功表达的cBD1为新型抗菌制剂的研制奠定了试验基础。