鸡Toll样受体3胞外区片段的克隆表达及多克隆抗体的制备

以笔者所在课题组扩增测序的广西三黄鸡Toll样受体3(TLR3)基因为基础,采用降落PCR法从鸡外周血淋巴细胞中扩增其胞外功能区片段chTLR3-LRR,并构建该片段的原核表达重组质粒,通过优化蛋白表达条件,用获得的融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,通过Western-blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果显示,该片段长度为834bp,与预测的片段大小、碱基序列相符;构建的原核表达重组质粒pET-chTLR3-LRR经IPTG诱导后,表达出预期的30ku的重组蛋白,所获得的鼠抗鸡TLR3多克隆抗体能够与经传染性法氏囊炎病毒(IBDV)刺激后的鸡胚成纤维细胞的TLR3蛋白发生特异性免疫反应。表明,所选择的区域片段具有很好的免疫原性,制备的鼠抗鸡TLR3多抗具有良好的特异性,这为进一步研究鸡TLR3的功能提供了重要材料。     

鸡Toll样受体3基因全长的扩增及生物信息学分析

利用RT-PCR方法从广西三黄鸡外周血淋巴白细胞中扩增出鸡Toll样受体3基因(TLR3),进而对其进行序列分析和结构预测。结果显示,扩增出的TLR3基因全长为3 036bp,与GenBank中鸡TLR3序列同源性达96.5%～99.7%,突变主要集中在胞外区前173个氨基酸;与牛、鼠、绵羊、猪、马、家兔、黑猩猩、人、大猩猩的氨基酸同源性较低,为68.0%～74.8%;禽类TLR3与其他动物类及人类的TLR3分属于两大不同分支,处于不同进化位置;结构预测表明,GX-sh-chTLR3具有明显的跨膜蛋白结构,胞外区蛋白是由外侧多个α螺旋和内侧凹陷的多个β折叠构成螺线管状马鞍形结构,胞外区含有15个明显的富含亮氨酸的重复序列。结果表明,成功扩增出的鸡TLR3基因编码蛋白的空间结构特征明显,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。