小反刍兽疫病毒H和F蛋白多抗原表位的表达及其反应原性

将通过计算机软件预测并通过间接ELISA检测确定的小反刍兽疫病毒(PPRV)H、F蛋白的10个B细胞抗原表位串联,再加上一个外源通用T细胞表位,表位之间用甘氨酸间隔,人工合成一条多抗原表位编码基因序列,将其插入原核表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)诱导表达。结果获得分子质量为19 ku的表达蛋白,该蛋白可与PPRV感染阳性血清发生特异性免疫反应。结果表明人工合成的PPRV多抗原表位编码基因可以在原核表达系统中表达,表达产物具有反应原性,这为研究PPRV抗原表位疫苗奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒非结构蛋白V基因的克隆及其编码蛋白的结构与功能

采用RT-PCR技术从小反刍兽疫病毒总RNA中扩增到P基因一段896bp序列,克隆至pET-30a(+)载体中,对其进行最大开放阅读框691位定点突变(插入一个G碱基),获得小反刍兽疫病毒V基因,利用生物信息学软件对麻疹病毒属V蛋白氨基酸序列进行比对,同时使用I-TASSER服务器对小反刍兽疫病毒V蛋白三级结构进行同源建模,分析其结构与功能。结果显示,小反刍兽疫病毒V蛋白氨基酸序列与麻疹病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒和海豹瘟病毒V蛋白的相似性分别为61.1%、56.0%、61.7%和51.7%,三级结构预测显示V蛋白由多α-螺旋的N-端结构域、中间结构域和含锌指结构的C-端结构域组成。本研究成功克隆了小反刍兽疫病毒V基因,预测分析了V蛋白结构和功能的关系,为其分子生物学和功能的进一步研究奠定了基础。     

猪IFN-γ基因的融合表达及其表达产物的生物学特性

依照猪IFN-γ(pIFN-γ)成熟蛋白基因序列设计引物,将已扩增的pIFN-γ基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了GST-pIFN-γ融合表达载体,该载体转化宿主菌BL21后用IPTG进行诱导表达并对诱导表达条件进行了筛选和优化,筛选出最佳诱导表达条件后大量诱导表达,可溶性的表达产物经GST琼脂糖凝胶亲和纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化.经SDS-PAGE和Western-blot分析,证实得到了高纯度的融合蛋白,该蛋白的分子质量为42ku.选择FMDV和PRV两种不同的病毒(RNA病毒和DNA病毒)进行GST-pIFN-γ抗病毒活性测定.结果表明,GST-pIFN-γ融合蛋白可有效抑制这两种病毒引起的细胞病变,其对FMDV的抑制作用远远大于对PRV的抑制.对GST-pIFN-γ融合蛋白的稳定性及机体毒副作用的研究表明,该pIFN-γ的稳定性有较大提高,而毒副作用大大降低.     

小反刍兽疫病毒RT-PCR检测方法的建立

通过分析小反刍兽疫病毒(PPRV)不同毒株的N基因序列,根据N基因保守区序列设计了1对引物,根据肌动蛋白基因序列设计了另1对引物作为内参,建立了小反刍兽疫RT-PCR诊断方法,预期扩增片段分别为687bp和493bp。以PPRVNigeria75/1株RNA和山羊组织总RNA混合物为模板,在RT-PCR反应体系内同时加入绵羊肌动蛋白基因引物和PPRVN基因引物,结果可扩增出2条目的条带,序列测定结果证实,分别扩增出了目的基因。对RT-PCR反应条件进行了优化,在最佳反应条件下,该RT-PCR最低可检测到12TCID50/mL的病毒RNA。用该方法对人工感染PPRVNigeria75/1株山羊的血液样品进行检测,结果可扩增出目的基因片段。表明建立的RT-PCR方法具有较好的特异性、敏感性和准确性。     

鸡球虫三价弱毒疫苗对鸡的免疫效果研究

将100只3日龄罗曼雏鸡随机分成空白对照组、攻虫对照组、Ⅰ组(1个免疫剂量)、Ⅱ组(2个免疫剂量)和Ⅲ组(0.5个免疫剂量)共5个试验组,每组20只鸡,对研制的鸡球虫三价弱毒疫苗的安全性和免疫效果进行初步评价。结果,各组的相对增重率依次为100.0%、86.8%、81.8%、89.2%和89.7%;攻虫后第10 d剖检所有鸡,各组肠道病变记分依次为0、2.7、2.2、2.3和2.6;免疫期间,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的OPG值依次为5.7×106、6.7×106和7.3×106;攻虫期间,攻虫对照组的OPG值为12.3×106,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的OPG值依次为7.2×106、8.5×106和9.0×106。攻虫后各组的死亡率依次为0、5%、0、10%和0;各组的抗球虫指数依次为200.0、115.8、135.8、140.2和143.7。结果表明,该三价弱毒疫苗抗柔嫩艾美球虫的效果并不理想,还需要进一步改进和完善。