猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株VP1蛋白的原核表达及其反应原性

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株的基因组序列(GenBank登录号:DQ355222)设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出了PTV的VP1基因片段,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET-VP1,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3)中,并进行IPTG诱导表达.结果表明,重组菌可表达分子质量为45 ku的融合蛋白,在1.0 mmol/L IPTG诱导6 h后,重组菌的表达效果最好,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的63.4%,表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中.表达产物经Ni柱纯化后,薄层扫描显示,目的蛋白的纯度达到了97%.Western-blot结果显示,纯化后的VP1蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,表明,原核表达的VP1蛋白具有良好的反应原性.     

猪轮状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)代表株OSU毒株序列,针对VP7基因设计了1对特异性引物,将150bp目的片段与pMD18-T载体连接构建标准品,建立了检测A群PoRV的SYBR GreenⅠreal-timePCR方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了评价。结果显示,该方法在1.3×108copies/μL～1.3×102copies/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限为1.3×101copies/μL;用该方法检测猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪病毒性腹泻病毒均为阴性;批内及批间变异系数均低于2%。表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。用该方法抽检58份疑似病例的腹泻病料,结果检出53份阳性,同时用普通RT-PCR和快速检测试剂盒对这些病料进行检测,结果分别检出42份和32份阳性。用这3种方法对11例已知阳性的临床粪便样品进行检测,结果建立的检测方法与其他两种方法的符合率为100%。用该方法检测PoRV细胞培养物中的病毒载量为1.0×105copies/μL。结果表明,建立的检测方法为PoRV的早期诊断、分子流行病学调查以及疫苗质量的监测等提供了新的快速检测技术。     

猪流行性腹泻病毒CH/S株M蛋白全长的原核表达及其反应原性分析

根据猪流行性腹泻病毒(PEDV)CH/S株M蛋白的基因组序列,设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出M基因,将其克隆至原核表达栽体pMXB10,构建了重组质粒pMXB-M,经测序鉴定正确后转化感受态细胞BL21(DE3),并进行了IPTG诱导表达.结果显示,重组茵pMXB-M表达的融合蛋白MBP-M-CBD(rM)...