山羊痘病毒SERPIN蛋白抑制宿主细胞凋亡活性的鉴定

采用PCR扩增长为1 041bp的山羊痘病毒(GTPV)serpin基因,构建真核表达质粒pcDNA-Ser-pin;将其转染HeLa细胞,经G418筛选,克隆纯化、鉴定,获得1株稳定表达GTPV SERPIN蛋白的HeLa细胞株;然后通过检测凋亡诱导剂TNF-α和放线菌酮作用后的细胞形态学变化、细胞活力和caspase活性,对GTPV SERPIN蛋白抑制宿主细胞凋亡的活性进行了鉴定。序列分析结果表明,GTPV SERPIN与正痘病毒SPI-1和SPI-2的氨基酸序列同源性为36%～38%;与痘苗病毒SPI-2空间构型相近,VADC基序和P1氨基酸(天门冬氨酸)相同。细胞试验结果显示,GTPV SERPIN蛋白能抑制由TNF-α和放线菌酮诱导的细胞凋亡,抑制率达70%左右,且这种抑制作用与其下调细胞caspase-8活性有关。证实GTPV SERPIN能抑制宿主细胞凋亡,可能是GTPV的致病因子之一。     

山羊Toll样受体基因TLR2和TLR4及TLR9的荧光定量PCR检测方法的建立

根据山羊Toll样受体(TLR2、TLR4和TLR9)及管家基因β-actin的保守序列设计特异性引物,分别建立不同的荧光定量PCR标准曲线及直线回归方程,并对方法的灵敏度、重复性和特异性进行检验。结果表明:山羊TLR2、TLR4、TLR9及管家基因β-actin的荧光定量RT-PCR标准曲线相关性R2大于0.984;特异性强,出现特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的方法对N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒(△N1L株)感染山羊外周血淋巴细胞TLR2和TLR9 mRNA表达水平进行了检测,△N1L株可以显著提高机体固有免疫应答水平。本研究建立的山羊天然免疫因子相关受体荧光定量PCR方法可应用于山羊痘新型基因工程疫苗的评价。