鸡IFN-γ基因的原核表达及其表达产物的抗NDV活性

设计了1对特异性引物,从含有广西三黄鸡IFN-γ基因的重组质粒pMD18-ChIFN-γ中扩增出鸡的IFN-γ基因,将该基因插入到原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达质粒pGEX-ChIFN-γ,并将其转入到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot分析,其分子质量约为42.4 ku,表明鸡IFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。采用NDV国内参考强毒株F48E9对复性后的IFN-γ进行了活性测定;结果显示,IFN-γ的抗病毒活性为1.33×104U/mL。     

广西鸡毒霉形体的分离与鉴定

从广西不同地区采集疑似鸡毒霉形体 (MG)感染的 46份病鸡病料中分离到 7个菌株 ,经分离培养、L形细菌检验、理化特性鉴定、血清学定型、人工感染试验以及PCR扩增检测等方法鉴定 ,确定 7个分离株为MG。     

用SDS-PAGE分析鸡毒霉形体广西分离株的结构蛋白

应用SDS PAGE对鸡毒霉形体 (Mycoplasmagallisepticum ,MG) 4个标准株和 5个广西分离株的结构蛋白进行了比较分析。结果 ,在凝胶电泳图谱中 10～ 10 0ku蛋白分子质量之间 ,F株缺少 87ku蛋白带 ,Y3株在最靠近 87ku蛋白带的上方和下方各缺少 1条蛋白带 ,H2株和Y2株缺少 6 4ku蛋白带 ,CH株缺少 2 9ku蛋白带 ,97、75、4 3ku处的蛋白带为 4个MG标准株和 5个MG分离株所共有。表明 9个MG供试菌株的结构蛋白都存在一定的差异 ,广西MG分离株的结构蛋白呈现多样性。     

用RAPD技术分析鸡毒霉形体广西分离株的DNA多态性的研究

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术 ,以随机引物成对组合的方式对鸡毒霉形体(MG) 5株广西分离株和 3株标准株DNA进行了多态性分析。结果显示 ,所选用的 2 0条引物中 ,有 3对 (6条 )引物扩增的条带为 2～ 10条 ,大小在 2 0 0～ 30 0 0bp。相似指数分析显示 ,广西MG分离株Y2与WL、CH与Y3的相似指数最高 ,分别为 0 .92和 0 .86 ,其与H2的相似指数为 0 .36～ 0 .6 2。 3株MG标准毒株S6、K2 2 2 1、K15 0 1与广西分离株间的相似指数为 0 .17～ 0 .5 7。表明广西流行的MG与MG标准株存在差异 ,当地的流行株也呈现多样性     

Ⅰ群禽腺病毒抗体间接hexon-ELISA检测方法的建立

为建立一种检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)抗体的间接ELISA方法,以FAVⅠhexon重组蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立了FAVⅠ抗体间接hexon-ELISA检测方法。抗原最佳包被浓度为10.0μg/mL,最适包被条件为37℃2h加4℃过夜;最佳封闭液为50g/L脱脂乳;血清最佳稀释度为1∶100,最佳作用时间为75min;酶标二抗最佳工作浓度为1∶2 000,最佳作用时间为45min;hexon-ELISA阴性、阳性临界值为0.379。用建立的hexon-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为45%。结果表明,建立的hexon-ELISA方法简便、快捷,可大批量检测,具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于FAVⅠ的诊断、抗体水平监测及流行病学调查。     

鸡细小病毒荧光LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种可鉴别鸡细小病毒(ChPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。根据鸡细小病毒NS1基因的保守序列,设计了1套特异性引物,在该套引物的F3与B3区域中设计1个探针,其探针用FAM标记,优化建立了能鉴别ChPV的荧光LAMP检测方法,并使用所建立的方法对21份临床样品进行检测。结果显示,该方法特异性好,能检测到ChPV,并与其他禽类病毒无交叉反应;灵敏度高,最低能够检测1.02×10^-5ng/μL的ChPV DNA模板;对临床可疑样品的检出率为24%。表明,本研究建立的ChPV荧光LAMP方法具有简便快速、特异性好、敏感性高等优点,可用于检测ChPV。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌二重实时荧光PCR检测方法的建立

根据结核分枝杆菌23SrRNA基因序列和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计了2对针对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,建立了结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重实时荧光定量PCR检测方法,并对建立的方法进行敏感性、特异性测定和临床样品检验。结果显示,该方法特异性好,能区分不同模板浓度组合的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;可检测到10copies模板的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌;对保存的50份PPD检测阳性牛的鼻黏液、牛乳和淋巴结进行检测,结果6份结核分枝杆菌阳性,1份牛分枝杆菌阳性,其余均为阴性,与PCR的检测结果一致。由此可见,建立的二重实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、可定量检测等优点,适合用于结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的鉴别检测。     

应用聚合酶链反应扩增鸡传染性喉气管炎病毒TK基因的研究

根据鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因的核苷酸序列设计并合成1对引物,用该引物对4株不同的ILTV进行PCR扩增.结果全部ILTV毒株均获得与试验设计相符的647 bp的扩增片段,而对其它6种禽病原体的扩增结果均为阴性;敏感试验表明,该引物能检出10 pg的ILTV DNA.     

应用多重聚合酶链反应检测鸡毒霉形体和滑液霉形体的研究

根据鸡毒霉形体（ ＭＧ） 、滑液霉形体（ ＭＳ） 的基因文库,设计并合成了分别与ＭＧ、ＭＳ 某段基因序列互补的两对引物,用这两对引物进行多重聚合酶链反应（ ＭｕｌｔｉＰＣＲ） 同时检测ＭＧ 与ＭＳ。当样品中同时含有ＭＧ 和 ＭＳ 的目的模板ＤＮＡ 时,均同时得到２ 条大小与试验设计相符的７３２ ｂｐ（ ＭＧ） 和２０７ ｂｐ （ ＭＳ） 的ＰＣＲ 扩增带;而对其它８ 种禽病病原的扩增均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重ＰＣＲ 技术最低能同时检出１００ ｆｇ 的ＭＧ、ＭＳ ＤＮＡ 模板量