猪三种细胞因子基因的克隆与序列测定

利用RTPCR技术,从植物凝集素(PHA)、脂多糖(LPS)诱导的猪外周血淋巴细胞(PBMC)中成功地克隆了IL2、IL4、IFNα1基因,诱导后第6～24h细胞因子转录基因量最丰富;诱导剂LPS和PHA联合使用的效果优于LPS或PHA单独使用的诱导效果。序列测定与分析表明,克隆的IL2、IL4和IFNα1基因与相应的参考序列的同源性分别是98.5%、99.0%和97.6%。     

大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

以热灭活的大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)菌体抗原为免疫原,E.coli O157∶H7菌体结合脂多糖(LPS)为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备E.coli O157∶H7LPS单克隆抗体。采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶(HRP)酶标抗体,并建立检测E.coli O157∶H7的双抗体夹心ELISA方法。结果,成功制备了9株稳定分泌E.coli O157∶H7LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中7F9和7G2为LPS O-特异性多糖(O-SP)单克隆抗体,与E.coli O157∶H7菌体具有较好的反应性。此双抗体夹心ELISA方法对与受试的非O157菌株没有交叉反应,对E.coli O157∶H7纯培养菌液的检出下限为3×104CFU/mL。结果表明,建立的ELISA检测方法对E.coli O157具有较高的特异性和灵敏度,该方法有望与其他方法相结合用于对E.coli O157∶H7的检测。     

黄芪总黄酮对脂多糖体外诱导的RAW264.7细胞的细胞因子和NO分泌水平的影响

为了研究黄芪总黄酮(TFA)的体外抗炎作用,通过脂多糖体外诱导小鼠RAW264.7细胞建立炎症模型,采用MTT法检测黄芪总黄酮的细胞毒性作用,用ELISA检测细胞上清液中IL-6、IFN-γ、IL-1β及TNF-α水平,采用Griess法检测细胞内NO表达水平。MTT结果显示,10~100μg/mL TFA对RAW264.7细胞没有明显的毒性作用。与模型组比较,10、25、100μg/mL TFA均能抑制RAW264.7细胞过量分泌IL-6、IFN-γ、IL-1β、TNF-α及NO,且呈一定的量效关系。本试验结果表明黄芪总黄酮具有体外抗炎活性。     

丹皮酚抑制脂多糖诱导的血管内皮细胞TNF-α 释放对共培养体系中血管平滑肌细胞凋亡及 p38 MAPK信号通路的影响

目的 观察丹皮酚（Paeonol，Pae）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）损伤的大鼠血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）炎性因子释放及对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）凋亡的影响，阐明Pae抑制VSMCs凋亡是否通过影响VECs释放的炎性因子调控p38 MAPK信号通路。方法 组织块预消化贴壁法原代培养VECs和VSMCs；Transwell小室建立VSMCs和VECs共培养体系；LPS诱导VECs损伤；MTT方法检测细胞存活率；ELISA检测VECs分泌肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）的水平；流式细胞仪检测VSMCs凋亡率；Western blotting检测VSMCs中p38 MAPK信号通路及凋亡相关蛋白表达。结果 与正常对照组比较，LPS可显著提高VECs分泌的TNF-α水平（P＜0.05），明显升高共培养体系中VSMCs p38 MAPK信号通路蛋白及凋亡相关蛋白（p-MKK3/6、p-p38、p53和Cleaved caspase-3）水平（P<0.05），显著提高VSMCs凋亡率（P<0.05）；与LPS刺激组比较，Pae可显著抑制VECs分泌的TNF-α（P＜0.05），明显降低共培养体系中VSMCs p38 MAPK信号通路蛋白及凋亡相关蛋白（p-MKK3/6、p-p38、p53和Cleaved caspase-3）水平（P＜0.05），显著降低VSMCs凋亡率（P＜0.05）。结论 Pae可抑制VECs释放TNF-α，从而抑制p38 MAPK信号通路，进而减少VSMCs凋亡。     

不同浓度脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞对NF-κB及LAP表达的影响

为了观察不同浓度脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞NF-κB及LAP基因表达的影响,设置不同浓度(0、50、100、200、400和800ng/mL)的脂多糖(LPS)刺激奶牛乳腺上皮细胞,分别于刺激2、4、8、16、24、48和72h后提取细胞总RNA,经反转录反应后,运用荧光定量PCR方法检测NF-κB P65亚单位和LAP的表达水平。结果,与空白对照组相比,脂多糖浓度达到400ng/mL并培养72h后,奶牛乳腺上皮细胞NF-κB P65亚单位和LAP的表达量最高,且与对照组有极显著差异(P<0.01)。结果表明,在脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性效应中,NF-κB的表达活性增强,调控着防御基因LAP表达,呈现一定的剂量和时间效应关系。     

酸枣仁皂苷A对脂多糖诱导星形胶质细胞C6氧化损伤的保护作用

目的 采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导星形胶质细胞C6的氧化应激模型，以研究酸枣仁皂苷A（Jujuboside A，JuA）的抗氧化活性。方法 体外培养大鼠星形胶质细胞C6。采用MTT法检测各组细胞的存活率，采用Western blot法检测星形胶质细胞标记蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的活化情况，采用Griess还原法测定细胞上清液中一氧化氮（nitric oxide，NO）水平，采用流式细胞术检测各组细胞中活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，采用ELISA测定各组细胞内丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（L-glutathione，GSH）水平以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。结果 0.125～50 μmol/L JuA对C6细胞存活率无明显影响（P＞0.05）；1 μg/mL LPS可以明显升高C6细胞GFAP蛋白表达水平，显著升高细胞上清液中NO和细胞内ROS、MDA水平，降低细胞内GSH水平和SOD活性，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与LPS组比较，12.5、25、50 μmol/L JuA可以明显抑制LPS诱导的GFAP表达，降低细胞上清液中NO水平，降低细胞内ROS、MDA水平，升高细胞内GSH水平和SOD活性，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 JuA对LPS诱导的星形胶质细胞氧化损伤具有一定的保护作用。     

五味子乙素对脂多糖诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织病理损伤、炎症反应和核因子-κB表达的影响

目的 观察五味子乙素对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织病理损伤、炎症反应和核因子 -κB （nuclear factor kappa-B，NF-κB）表达的影响。方法 采用气管滴注40 mg/kg LPS制备大鼠急性肺损伤大鼠模型，手术前1 h腹腔注射80 mg/kg 五味子乙素进行干预治疗，测定大鼠肺湿/干质量比，BCA试剂盒测定大鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalceolar lavage fluid，BALF）总蛋白，牛鲍氏计数板计算 BALF中白细胞数，苏木精-伊红染色观察大鼠肺组织损伤情况，ELISA法检测大鼠肺组织中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）含量，相关试剂盒检测大鼠肺组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）含量，蛋白质印迹法检测大鼠肺组织中NF-κB p65、磷酸核因子- κB 抑制蛋白（phosphorylation inhibitor of nuclear factor kappa-B，pIκBα）和Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）的表达水平。结果 与模型组相比，五味子乙素组大鼠肺湿/干质量比、BALF中总蛋白含量及白细胞数均显著减少（P<0.05），病理损伤显著减轻，TNF-α、IL-1β、IL-6含量均显著减少（P<0.05），MDA含量显著下降，SOD活性显著升高（P<0.05），NF-κB p65、pIκBα和TLR4表达水平均显著下调（P<0.05）。结论 五味子乙素能够减轻LPS诱导的脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织的病理损伤，抑制炎症反应和氧化应激反应，抑制NF-κB通路激活。     

伊维菌素对内毒血症小鼠生存率和细胞因子分泌的影响

为研究伊维菌素对脂多糖所致内毒血症小鼠的保护率及对小鼠血清中细胞因子的影响,给C57BL/6小鼠灌服伊维菌素(1、2和4mg/kg)或等体积蒸馏水,2h后分别腹腔注射脂多糖32mg/kg或等体积PBS,观察7d内小鼠的死亡情况;采用夹心-ELISA法测定注射脂多糖后不同时间点小鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平,硝酸还原法测定小鼠血清中NO的水平。结果显示,伊维菌素能显著(P<0.05)提高脂多糖诱导的内毒血症小鼠生存率,降低小鼠血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6和NO水平。表明,伊维菌素可通过抑制脂多糖诱导的小鼠体内炎性因子和介质释放提高内毒血症小鼠的生存率。     

脂多糖诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB的表达

通过研究脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB亚单位P65蛋白mRNA的表达变化,从细胞水平深入探讨子宫内膜炎的发病机理。将奶牛子宫内膜上皮细胞传代培养,采用1、10、50、100、1000μg/mL五个浓度梯度的LPS刺激子宫内膜上皮细胞,MTT法筛选最佳刺激浓度;以上述最佳刺激浓度刺激细胞,于0、0.5、1、2、4h后收集细胞,荧光定量RT-PCR检测p65 mRNA的表达差异性。结果显示,100μg/mLLPS为最佳刺激浓度;LPS刺激1h组p65 mRNA的表达极显著(P0.01)高于其他时间组;2h组显著(P0.05)高于0、0.5和4h组;0.5和4h组显著(P0.05)高于0h组。结果表明,LPS可诱导奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB的激活,LPS介导的NF-κB信号通路存在于奶牛子宫内膜上皮细胞中,并参与子宫内膜炎发病机理的调控。     

丹皮酚对脂多糖诱导的大鼠血管内皮细胞VCAM-1、TNF-α释放及TLR4/NF-κB信号通路的影响

目的观察丹皮酚(Paeonol,Pae)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)释放血管内皮细胞黏附因子-1(vascular endothelial cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及Toll样受体-4(toll-like receptor,TLR4)/核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路的影响,以阐明Pae抑制VECs黏附功能的分子机制。方法组织块预消化贴壁法分离培养VECs,采用LPS诱导VECs炎性损伤;健康大鼠灌胃给予Pae制备含药血清,反相高效液相色谱法测定血清Pae的含量;RT-PCR法检测TLR4mRNA的表达;凝胶迁移试验检测NF-κB蛋白的表达;免疫组织化学检测VCAM-1的表达;放射免疫法检测TNF-α的表达。结果 Pae含药血清(2.5,5,10μg/mL)作用于LPS诱导的VECs 24h,可抑制VECs中TLR4mRNA和NF-κB蛋白表达,以及VCAM-1和TNF-α分泌,呈现一定的剂量依赖性,其中Pae 10μg/mL的抑制作用均具有统计学意义(P0.05)。结论 Pae降低TNF-α的释放和VCAM-1水平,可能是通过下调LPS诱导的TLR4/NF-κB信号通路的活化而实现的。