细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——六钩蚴排泄分泌抗原及原头节可溶性粗抗原的SDS-PAGE

本文应用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)首次对细粒棘球绦虫六钩蚴排泄分泌(ES)抗原的多肽组分进行了分析并同时对牦牛源棘球蚴原头节可溶性粗抗原的多肽组分进行了分析。应用10％凝胶,采用垂直板型电泳、考马斯亮蓝R-250染色进行SDS-PAGE的结果表明,六钩蚴ES抗原至少由14种多肽组分组成,分子量范围270～17.5KD,其中主要组分6种。原头节可溶性粗抗原至少由25种多肽组分组成,分子量范围230～17KD,其中主要组分13种。本项研究为功能性抗原的进一步分析、分离奠定了基础。     

细粒棘球绦虫六钩蚴EG95抗原基因的克隆及原核表达

利用RT PCR从激活的细粒棘球绦虫六钩蚴中扩增了EG95 cDNA,并亚克隆至原核表达载体pGEX 4T 1上,转化至大肠埃希氏菌BL21,用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白质。结果表明,从六钩蚴中克隆到了EG95 cDNA,序列长度为481 bp,包括471 bp的开放阅读框,与新西兰株EG95抗原基因序列完全一致;SDS PAGE电泳结果显示,重组表达质粒产生了约42 ku的目的带,其中EG95蛋白质的分子质量约为15.2 ku,与预期结果一致;Western blotting试验检测表明,融合表达产物可与囊性包虫病人血清发生反应。试验结果提示,EG95 基因高度保守,所表达的EG95蛋白作为抗原疫苗具有广泛的适用性。     

青海省羊源细粒棘球蚴EG95基因的克隆与序列分析

从青海省羊源细粒棘球蚴中提取基因组DNA ,用EG95特异性引物进行PCR扩增 ,并克隆至 pGEM TEasy载体上 ,经PCR、EcoRⅠ酶切和测序鉴定后 ,用DNAstar软件对 3个克隆的DNA序列进行同源性分析。结果表明 ,EG95基因的 3个序列 (EG95 QH 1、EG95 QH 2和EG95 QH 3)的片段大小为 14 35～ 14 37bp ,与GenBank中的EG95基因同源性为 73.2 %～99.2 % ,差异集中在内含子区域。其中EG95 QH 1、EG95 QH 3与GenBankEG95XJ ag、EG95 4序列的同源性较高 ;EG95 QH 2与GenBank中EG95 1、EG95 2、EG95 3序列的同源性较高。研究结果表明 ,青海羊源细粒棘球蚴EG95基因的 3个序列为EG95基因家族的成员。     

EgM家族蛋白诱导犬免疫应答动态ELISA检测方法的建立

为建立用重组GST融合EgM家族(EgM9和EgM123)蛋白和GST蛋白免疫的犬血清中由靶蛋白(EgM家族)产生的特异性抗体的检测方法,用GST融合EgM9和EgM123蛋白及GST蛋白为抗原,辅以弗氏佐剂分别免疫试验犬3次,100μg/只,并设GST蛋白组和PBS组为对照。三免后第2周,用羊源原头蚴进行口服感染,25 000枚/只,每周采血直至感染后第45天,以GST融合EgM9和EgM123蛋白包板,用中和反应处理血清中由GST蛋白和大肠杆菌产生的抗体,之后用间接ELISA和Western-blot方法检测血清中IgG、IgM和IgA的水平。结果显示,预处理的犬血清能去除GST蛋白和大肠杆菌诱导的抗体。二免后IgG和IgM水平达到峰值,IgG应答水平随免疫和感染仍能保持高应答水平。三免后IgG应答水平未提高。第三次免疫后IgM应答水平逐渐下降。IgA产生低的免疫应答,随免疫刺激和感染没有显著的变化。结果表明,EgM9和EgM123靶蛋白免疫犬能产生高水平的免疫应答,说明用吸收非特异性抗体监测特异性抗体的方法是可行的。     

EgM9蛋白免疫犬肠系膜淋巴结中抗体的免疫荧光组织化学定位

以EgM蛋白免疫犬、EgM蛋白免疫后感染原头蚴犬及感染原头蚴犬3个组的肠系膜淋巴结为材料,用FITC标记羊抗犬IgG扣羊抗兔IgG,分别采用一步法和三步法免疫荧光技术检测EgM蛋白免疫犬肠系膜淋巴结上的IgG和特异性IgG.结果显示,EgM蛋白免疫犬、EgM蛋白免疫后感染原头蚴犬的肠系膜淋巴结组织有清楚可见的荧光点,而感染原头蚴犬的肠系膜淋巴结荧光较弱.两种方法均证明,EgM蛋白免疫犬后在其肠系膜淋巴结中可以产生特异性抗体.     

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——绵羊牦牛棘球蚴囊液几项生化指标的比较

本文应用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦(IEF)电泳首次对绵羊、牦牛棘球蚴囊液的蛋白质、糖、脂及酯酶同功酶进行了初步分析。结果表明,用考马斯亮蓝R-250染蛋白质分别显示38及36条带;用RAS染糖,分别显示19及22条带;用Nile＇s蓝染脂,均显示7条带;用坚固蓝染酯酶同功酶,分别显示20及10条带。两者上述几项生化指标的差异是宿主特性不同的一个反映。本项研究为进一步阐明绵羊、牦牛棘球蚴囊液的生化特性积累了资料。     

细粒棘球绦虫cDNA克隆EgA31在大肠埃希氏菌M15中的表达及重组蛋白的纯化和复性

为了获得细粒棘球绦虫 66ku抗原的重组蛋白和抗血清 ,用该抗原的cDNA克隆EgA3 1构建了pQE3 0EgA3 1重组质粒 ,在大肠埃希氏菌M15中表达 ,经亲和层析获得纯度较高的EgA3 1重组蛋白 ;用经复性处理的重组蛋白免疫动物 ,获得EgA3 1重组蛋白抗血清。本文就重组蛋白的稳定性和在复性处理中遇到的问题进行了讨论。     

我国三省区细粒棘球绦虫基因的变异分析

对从青海省、甘肃省和新疆维吾尔族自治区采集的 2 4株细粒棘球蚴 ,用线粒体DNA的CO1基因和ND1基因结合rDNA的ITS2测序 ,调查了不同地区分离株基因型的变异情况。结果显示 ,所有分离株均为普通羊株 (G1基因型 ) ;CO1基因序列的变异率为 0～ 0 .8% ,ND1基因的变异率为 0 .1%～ 0 .7% ;青海分离株ITS2序列的变异率为 0 .4 %～ 3.1% ;2株青海省西宁市和 1株甘肃省武威市分离株分别在CO1基因和ND1基因序列不同位点发生的 1处核苷酸非同义替换 ,导致 1个编码的氨基酸替代。研究表明 ,我国上述 3省、区部分区域存在的细粒棘球蚴属于同一株 (G1基因型 )。