羊口疮病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

参照GenBank中登录的羊口疮病毒(ORFV)序列(Gu320351),针对OrfV的B2L基因保守区域设计了4条引物,通过优化反应条件,建立了检测OrfV的环介导等温扩增技术(LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测。结果显示,用建立的LAMP方法对OrfV阳性样品扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而绵羊痘病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、丝状支原体山羊亚种、山羊痘病毒及健康山羊皮肤的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对OrfV的最低检出量为5.3fg,比常规PCR方法高1 000倍。表明建立的LAMP方法特异性强,敏感性高。对6份临床样本的检测结果显示,OrfV阳性检出率为83.33%(5/6),与常规PCR的符合率为100%。本试验为羊口疮病例的临床诊断和OrfV的快速检测提供了新的方法。     

猪链球菌血清2型环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立快速、灵敏的猪链球菌血清2型(SS2)LAMP检测方法,根据GenBank登录的SS2特异的荚膜多糖(cps2 H)基因序列作为检测靶标,在其序列的保守区域设计LAMP引物,利用参考菌株S735基因组DNA为模板进行扩增,优化了LAMP的反应条件和反应体系,并进行了敏感性、特异性和重复性试验。结果,利用建立的LAMP方法对SS2进行扩增,扩增产物显色呈现阳性反应,电泳出现阶梯状条带,最低检测量为0.186fg/μL模板DNA,比常规PCR高1 000倍;且与其他常见的细菌无交叉反应。结果表明,建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速和重复性强等优点,适用于猪链球菌病的实验室快速检测。     

旋毛虫LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种快速、准确的动物肉品中旋毛虫检测方法,根据旋毛虫ITS-Ⅱ基因序列,设计环介导等温扩增技术(loop-m ediated isothermal amplification,LAMP)引物,进行LAMP扩增。将旋毛虫DNA进行梯度稀释,以其为模板分别进行LAMP和常规PCR扩增,分析LAMP检测技术的敏感性。分别以旋毛虫、弓形虫、捻转血矛线虫、柔嫩艾美耳球虫、猪囊尾蚴、大肠杆菌等病原的基因组DNA为模板,进行LAMP检测,分析该检测方法的特异性。用该LAMP检测方法,分别对模拟样品和市售猪舌、鸭舌、鸡舌、羊舌和牛舌等110份样品进行旋毛虫感染情况检测。LAMP扩增产物的电泳结果和可视化SYBR G reen I荧光染料颜色的变化均表明该LAMP检测方法建立成功。当模板DNA稀释到10~(12)时亦可以检测,其敏感性是常规PCR的1 000倍。特异性研究发现,只有以旋毛虫基因组DNA为模板所进行的LAMP检测才出现阶梯形的电泳条带并且其SYBR Green I荧光染料呈现绿色荧光。在2 g肌肉中添加1条旋毛虫肌幼虫时亦能被该LAMP方法检测出来。但110份舌肌样品中均未检测到旋毛虫,LAMP检测结果与常规PCR结果一致。结果表明,本研究建立了基于旋毛虫ITS-Ⅱ基因的LAMP检测技术,该技术具有较好的敏感性和特异性,在样品检测中具有简便快捷的优点。     

牛新孢子虫病LAMP检测方法的建立

为建立一种快捷、灵敏的牛新孢子虫病检测方法,根据GenBank上登录的新孢子虫NcSAG1基因(AF132217)序列设计合成了2对环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立了检测牛新孢子虫病的LAMP技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验.结果显示,LAMP方法扩增牛新孢子虫的电泳产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光,酶切鉴定出现目的条带,LAMP方法检测的敏感性为5×10~5 copies/μL;特异性试验显示,新孢子虫检测管显色后呈阳性,而瑟氏泰勒虫、弓形虫和附红细胞体等对照组均呈阴性.表明,本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛新孢子虫病的检测.     

食品中沙门氏菌DNA环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据沙门氏菌属高度保守的fimY基因序列设计了2对特异性引物,采用环介导等温扩增方法(LAMP)建立了食品中沙门氏菌的LAMP快速检测方法。结果表明,建立的LAMP方法具有高度特异性,经对40种共68株细菌进行扩增,所试32株沙门氏菌均为LAMP阳性,其他菌株为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的沙门氏菌的检测灵敏度为5CFU/管,对污染食品中沙门氏菌的检测灵敏度为9CFU/管,60min内即可完成检测。用建立的LAMP方法对802份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出165份LAMP阳性样本,与国标(GB/T4789.4-2008)方法的检测结果一致。建立的LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

O157:H7型大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的肠出血性大肠杆菌保守基因序列Stx1、Stx2设计合成荧光定量PCR引物和探针,对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床分离病料进行了检测,并与常规PCR方法的检测结果做了对比.结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的灵敏度达7.06×103CFU/mL,比常规PCR方法的灵敏度高106倍.用该方法和常规PCR对8种样品进行了检测,证实,该方法与常规PCR的阳性符合率为100%,具有较好的重复性.     

兔出血症病毒与欧洲野兔综合征病毒复合RT-PCR检测方法的建立

为建立用于兔出血症病毒(RHDV)和欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)诊断鉴别的快速检测方法,根据GenBank中的RHDV和EBHSV基因组序列,设计合成5条特异性引物和9条重叠延伸引物,分别以通过重叠延伸PCR人工合成的EBHSV VP60基因中359bp基因片段构建的重组质粒pGM-T-EBHSV和RHDV RT-PCR产物构建的pGM-T-RHDV为模板,经过反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,初步建立了RHDV和EBHSV的复合RT-PCR检测方法,并对20份临床样品和5份RHDV人工感染样品进行了检测。结果表明,建立的复合RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可分别扩增出RHDV和EBHSV的特异性目的片段192bp和335bp,对2种病毒的检测限度均可达到50copies的目的基因片段,兔巴氏杆菌、兔大肠杆菌和沙门氏菌核酸扩增均为阴性。样品检测结果显示,5份人工感染样品的RHDV检出率为100%,20份临床样品的RHDV检测为阴性。     

应用三磷酸核苷水解酶基因检测弓形虫方法的建立

用Primer Explorer V4软件针对弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)基因设计了6条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,建立弓形虫LAMP反应体系,并进行特异性和敏感性试验。结果显示,用该反应体系30 min即可检测出弓形虫NTPase基因,产生瀑布状的特异性条带,检测极限为20 copies,敏感性比PCR高10倍。与犬新孢子虫、鹦鹉热衣原体、柔嫩艾美耳球虫、吕氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未定种和牛巴贝斯虫间无交叉反应,且重复性良好。应用此方法,可以在攻虫后第2天于试验猪血液中检测出弓形虫,比PCR方法提前2 d。表明将弓形虫NTPase基因作为环介导等温扩增检测弓形虫的目的基因,具有特异性强、敏感性高的特点,是快速诊断弓形虫病的一种新方法。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

大肠杆菌O157及其Stx2免疫胶体金层析检测方法的建立

建立了大肠杆菌O157和志贺毒素2(Stx2)的双抗体夹心免疫胶体金层析法,并运用该方法对上海市兽医生物技术重点实验室保存的已鉴定的58株大肠杆菌进行了检测,评估了其特异性、敏感性和重复性.结果显示,大肠杆菌O157层析法的敏感性为1×105CFU/mL,特异性为87.5%,批间和批内变异系数分别为8.6%和0;Stx2层析法的检测下限为200μL细菌培养液,特异性为50.0%,批间和批内变异系数分别为50.0%和33.0%.表明,该免疫胶体金层析法能快速、简便、特异地检测大肠杆菌O157;结合对Stx2的检测,能快速检出产Stx2的大肠杆菌O157菌株.     

鉴别猪胸膜肺炎放线杆菌2/6/8/12型的多重PCR方法的建立

为快速准确鉴别猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清2、6、8、12型,从已发表的文献中筛选出4对引物,通过扩增体系和扩增程序的优化来建立APP血清2、6、8、12型的多重PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果发现,所建立的多重PCR方法特异性良好,对APP血清1～15型进行PCR检测,除血清2、6、8、12型外,均不能扩增出任何条带,检测猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌和猪大肠杆菌也呈阴性,对APP血清2、6、8、12型的细菌纯培养物、组织样品的检测敏感性分别都为1×10~3CFU/mL、1×10~3CFU/g。本PCR方法快速有效,可在4.5 h左右直接从肺脏组织中得到检测结果。本方法的建立为APP的分子分型和流行病学调查提供了有力的技术支撑。     

可视化多重荧光LAMP鉴别诊断牛轮状病毒和产肠毒素性大肠杆菌的研究

本研究旨在建立一种同时检测牛轮状病毒(BRV)和产肠毒大肠杆菌(ETEC)的多重荧光LAMP检测方法。根据GenBank中BRV和ETEC的基因保守区域设计3套LAMP引物,在每条内引物FIP的5’端标记荧光基团,在同一体系中进行多重LAMP扩增,对各反应条件进行优化,应用该方法对采集自广西各地牛场的56份样品进行检测。结果显示,该方法能特异地鉴别牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌,并与其他对照病原不发生交叉反应;每个反应的检测灵敏度均为100拷贝。对56份腹泻样品的检测结果显示,BRV的感染率为14.3%,ETEC的感染率为57.1%,2种病原的混合感染率为8.9%;与荧光PCR和常规PCR检测方法相比,此多重LAMP方法敏感性为100%,符合率为100%。建立的方法可快速、准确地检测2种犊牛腹泻病原体,为病原学诊断和分子流行病学调查提供了有效技术支持。     

伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法的建立

为建立伪结核棒状杆菌可视化LAMP检测方法,根据伪结核棒状杆菌16S rRNA基因的特异性保守核苷酸序列设计2对引物,通过反应体系和反应条件的优化,建立了伪结核棒状杆菌可视化LAMP现场检测方法,并评价该方法的特异性和敏感性。结果显示,本实验所建立LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h。利用该方法检测大肠杆菌、肠炎沙门菌、金黄色葡萄球菌等山羊和绵羊常见的15种细菌的DNA样品,结果显示仅伪结核棒状杆菌检测为阳性,其他细菌检测为阴性。该方法对阳性质粒标准品pMD19-Cory的最低检出浓度为4.7 copies/μL。应用建立的LAMP方法和普通PCR方法对128份山羊皮下脓肿样品进行检测,结果显示LAMP方法和普通PCR方法的阳性率分别为21.1%(27/128)和20.3%(26/128),2种检测方法的总符合率为99.2%(127/128)。结果表明,本研究建立的可视化LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速的优点,为山羊和绵羊伪结核棒状杆菌感染的可视化现场快速诊断提供可行方法。     

用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列,设计了与PRV的 gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRV DNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为549 bp(gB)、429 bp(gD)、366 bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重 PCR扩增,均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明,多重 PCR可以检测到 106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明,以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,均无任何条带。     

牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR与LAMP及PCR检测方法的对比研究

本研究应用金纳米颗粒与PCR结合建立了牛传染性鼻气管炎病毒(BoHV-1)纳米PCR(nanoPCR)新型检测方法和LAMP可视化检测方法,并与普通PCR方法进行对比研究。建立的BoHV-1纳米PCR新型分子检测方法和LAMP方法,特异性良好,敏感性与LAMP方法和常规PCR对比结果显示,nano-PCR方法敏感性是LAMP和普通PCR的10倍,最低检出量为2.23×102copies/L,是普通PCR的100倍;LAMP样品检测用时最短,50 min即可得到检测结果。临床样品的阳性检出率nano-PCR方法最高,检出阳性样品8/10份(弱阳性1份),普通PCR阳性检出率最低,检出阳性样品3/10份,LAMP检出6/10份。结果表明,nano-PCR敏感性和特异性更适合于临床样品的检测。     

伪狂犬病病毒野毒株新型可视化环介导等温扩增检测方法的建立

利用环介导等温扩增（LAMP）与pH指示剂结合的方式建立伪狂犬病病毒（PRV）野毒株的快速检测方法，并优化反应体系。结果显示，该方法特异性良好、敏感性较高，检测限达 10~(0.5) TCID_(50)，与荧光定量PCR的敏感性一致。对52 份临床样品进行检测，用荧光定量PCR检测出30份阳性样品，LAMP检测出27份阳性样品，二者的符合率为94.2%。结果表明，PRV野毒株新型可视化LAMP检测方法操作简便、结果判别明显、检测成本低，可预期应用于PRV带毒猪的快速筛查，这对于猪伪狂犬病的净化具有重要意义。     

快速检测奶牛乳房炎四种病原菌的多重PCR方法的建立及应用

奶牛乳房炎是目前世界上困扰奶牛业经济效益及其发展的主要疾病之一。由于现有的检测手段繁琐复杂,所以急需一种特异敏感的检测手段对奶牛乳房炎进行快速、准确的诊断。本试验参照G en Bank发表的序列,在大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌各自保守的16-23S r RN A区域及白色念珠菌的18S r RNA区域设计了4对特异性引物,建立了检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和白色念珠菌等4种乳房炎主要致病菌的多重PCR方法。结果表明:本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性和敏感性,对参与试验的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌及白色念珠菌均能扩增出各自的阳性条带并且多重PCR检测的敏感度分别为1×102CF U/mL、1×104CFU/mL、1×105CFU/mL和1×102 CFU/mL。     

三种致奶牛流产病原多重巢式PCR检测方法的建立

为同步检测引起奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原,本研究分别设计针对新孢子虫ITS1基因(Nc-ITS1)、布氏杆菌16S rRNA基因(Ba-16S rRNA)及弓形虫529 bp重复序列基因(Tg-529 bp)的特异性巢式PCR引物,建立并优化了能够同时检测这三种病原的多重巢式PCR方法。结果显示,多重巢式PCR对Nc-ITS1、Ba-16S rRNA及Tg-529 bp扩增产物的大小分别为601 bp、380 bp、245 bp。外引物退火温度为57℃,内引物为53℃;Taq酶、dNTP和Mg2+浓度分别为1.0 U、2.0 mmol/L和1.0 mmol/L;Nc-ITS1和Tg-529 bp外、内引物浓度均为0.4 m ol/L,Ba-16S rRNA为0.2 mol/L。该多重巢式PCR对Nc-ITS1和Ba-16S rRNA检测敏感性达3×102 copies/L,对Tg-529 bp达3×101 copies/L,对住肉孢子虫、大肠杆菌、沙门菌、李氏杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌扩增均无目的条带,表明该多重巢式PCR方法具有良好的敏感性和特异性。利用该方法对86份临床样品进行检测,结果显示新孢子虫阳性样品26份,布氏杆菌阳性样品2份,弓形虫阳性样品1份,其中新孢子虫和布氏杆菌均为阳性的样品1份,与单巢式PCR检测结果一致。结果表明,建立的多重巢式PCR方法可以用来对致奶牛流产的新孢子虫、布氏杆菌和弓形虫这三种常见病原进行快速、准确地检测。     

伪狂犬病病毒野毒株新型可视化环介导等温扩增检测方法的建立

利用环介导等温扩增(LAMP)与pH指示剂结合的方式建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的快速检测方法,并优化反应体系。结果显示,该方法特异性良好、敏感性较高,检测限达100.5TCID50,与荧光定量PCR的敏感性一致。对52份临床样品进行检测,用荧光定量PCR检测出30份阳性样品,LAMP检测出27份阳性样品,二者的符合率为94.2%。结果表明,PRV野毒株新型可视化LAMP检测方法操作简便、结果判别明显、检测成本低,可预期应用于PRV带毒猪的快速筛查,这对于猪伪狂犬病的净化具有重要意义。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光LAMP检测方法的建立

本研究为建立一种检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的二重荧光(LAMP)技术,根据已发表的CSFV E2基因和PRRSV NSP2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PRRSV序列的特异性引物和2条探针,在CSFV探针5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PRRSV探针5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。用设计的引物、探针及反应试剂组成反应体系,建立CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法。对建立的方法进行特异性、敏感性、干扰性试验,并用临床样品进行验证。结果显示,本研究成功建立了鉴别CSFV和PRRSV的二重荧光LAMP方法,该方法只检测出CSFV(绿色)或PRRSV(红色)或CSFV和PRRSV混感(黄色),而对照毒株则无荧光颜色出现,具有较好的特异性。敏感性检测CSFV或PRRSV的含量浓度,其最低检测浓度均为100 copies/mL,敏感性较好。干扰性结果显示,高低不同的模板浓度不影响本方法的检测扩增,干扰性小。对112份采集的临床样品进行检测,结果,检出CSFV阳性样品41份,PRRSV阳性样品12份,CSFV和PRRSV同时为阳性的样品3份,该结果与荧光定量RT-PCR方法的检测结果一致。上述结果表明,本研究建立的CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,并具有检测临床样品中CSFV和PRRSV的潜力。