脑心肌炎病毒VP1基因重组腺病毒的构建及对小鼠免疫效果的研究

为构建脑心肌炎病毒(EM CV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体p Yr-adshuttle-4连接构建p Yr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得p Ad-VP1-EG FP重组腺病毒载体,将此载体于H EK 293细胞中包装最终成功获得r Ad-VP1-EGFP重组腺病毒,并测定其TCID50;构建的重组腺病毒感染细胞后在基因水平、蛋白水平对VP1进行检测;最后通过对小鼠免疫重组腺病毒后进行EMCV攻毒试验,验证其免疫效果。结果显示,成功构建了EMCV VP1基因重组腺病毒r Ad-VP1-EGFP,测得其TCID50为10-8.5/m L;感染细胞后基因水平及蛋白水平均可检测到VP1基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后的存活情况表明,重组腺病毒对小鼠有较好的免疫效果,且二次免疫后保护率显著高于单次免疫。结果表明,本试验成功制备了EMCV基因重组腺病毒,且对小鼠具有较好的免疫效果,可为进一步开发EMCV基因工程疫苗奠定基础。     

微小隐孢子虫P23基因真核表达质粒在HeLa细胞中的表达及其免疫小鼠血清抗体效价的检测

为观察微小隐孢子虫P23基因真核重组质粒在He La细胞中的表达及免疫小鼠血清抗体产生情况,通过设计特异性引物,利用PCR技术,对微小隐孢子虫卵囊基因组DNA进行P23基因扩增;将扩增产物插入真核表达载体p VAX-1中,构建重组真核表达质粒p VAX1-P23,转染He La细胞,运用间接免疫荧光法及Western-blot技术,验证重组质粒在He La细胞中的表达情况;将重组质粒p VAX1-P23免疫小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体产生情况。结果显示,成功地扩增了长度约为336 bp的微小隐孢子虫P23基因;双酶切和序列测定结果显示,构建的真核重组表达质粒p VAX1-P23中外源基因序列和插入位置正确;间接免疫荧光法及Western-blot分析显示,p VAX1-P23真核重组表达质粒在He La细胞中被成功表达;小鼠免疫重组质粒2周后,即可检测到抗体产生,直至第8周试验结束。结果表明成功地构建了真核重组表达质粒p VAX1-P23,该重组质粒能在He La细胞和小鼠体内表达,并诱导小鼠产生显著的体液免疫反应,为进一步开展隐孢子虫P23蛋白特性研究、研制抗隐孢子虫病核酸疫苗奠定了基础。     

山羊痘病毒L1R蛋白的原核表达及其免疫原性的研究

为探究山羊痘病毒L1R蛋白的免疫原性,将山羊痘病毒的L1R基因克隆到p ET-30a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后进行纯化,将纯化的重组L1R蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、淋巴细胞增殖和微量中和试验研究重组L1R蛋白的免疫原性及其多克隆抗体的抗病毒作用。结果显示,成功表达出分子质量约为26 ku的目的蛋白,其可被山羊抗绵羊痘阳性血清所特异性识别。重组L1R蛋白能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫,并且其多克隆抗体能够中和山羊痘病毒,从而证实山羊痘病毒L1R蛋白具有良好的免疫原性。     

IFN-λ1作为乙型脑炎病毒DNA疫苗佐剂的免疫效应研究

为了评估IFN-λ1作为免疫佐剂能否提高乙型脑炎病毒DNA疫苗的免疫效应,利用RT-PCR方法扩增猪源IFN-λ1基因,构建重组真核表达载体pVAX1-IFN-λ1,通过Western-blot和间接免疫荧光试验鉴定免疫效果。结果表明,转染pVAX1-IFN-λ1重组质粒的BHK21细胞能够正确表达IFN-λ1;将重组IFN-λ1与p VAX1-prME DNA疫苗免疫小鼠后,与对照组p VAX1-prME相比,IFN-λ1可以诱导小鼠产生乙型脑炎病毒EⅢ蛋白特异性抗体水平、乙脑病毒特异性中和抗体效价和淋巴细胞增殖水平显著提高。结论,重组猪源IFN-λ1作为乙型脑炎病毒DNA疫苗的分子免疫佐剂能够在小鼠动物模型上提高乙型脑炎病毒DNA疫苗的免疫效应。     

表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究猪流行性腹泻病毒中和抗原位点(COE)基因在乳酸菌中的表达情况,进而探讨重组乳酸菌的免疫原性。将COE基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG-1中,构建重组表达载体pPG-1-COE,并将其电转化入干酪乳杆菌Lactobacilluscasei393中,应用Western-blotting、间接免疫荧光染色和全细胞ELISA检测重组蛋白的表达情况,用重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠,测定免疫应答水平。结果表明,COE可在构建的重组干酪乳杆菌表达系统中表达,目的蛋白定位于细胞表面。在免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA(P0.01);血清具有中和活性(1∶12);脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,IL-4和IFN-γ水平显著提高(P0.01)。证实,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生对猪流行性腹泻病毒特异的黏膜免疫应答和系统免疫应答。     

猪脑心肌炎病毒P1和P12A3C基因重组腺病毒的构建及其在小鼠体内的免疫应答

为研制脑心肌炎病毒(EMCV)新型活载体疫苗,首先将病毒核衣壳前体多肽P1与P12A3C串联基因分别插入穿梭质粒pDC316中,构建得到了重组穿梭质粒pDC316-P1和pDC316-P12A3C。将其分别与辅助质粒pBHGloxΔE1、3Cre共转染293细胞,成功包装出重组腺病毒Ad-P1和Ad-P12A3C。免疫过氧化物酶单层试验确证,重组腺病毒可表达目的蛋白。分1次和2次肌肉注射免疫小鼠,然后通过间接ELISA试验和中和试验评价其诱导的特异性体液免疫水平。结果,Ad-P1诱导的VP1特异总抗体IgG水平显著高于Ad-P12A3C,但不能检测到明显的中和抗体(<1∶8);Ad-P12A3C能诱导产生良好的中和抗体(1∶32~1∶128),用1×108TCID50剂量EMCV BJC3株攻毒,Ad-P12A3C免疫组能获得100%的保护,而Ad-P1免疫组仅能获得部分保护。以上结果表明,Ad-P12A3C可作为良好的EMCV腺病毒活载体疫苗。     

PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原优势区基因真核表达质粒的构建及其免疫效果

采用PCR法扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2抗原优势区(ORF2′)基因和猪细小病毒(PPV)VP2基因,将目的基因定向插入真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2′-VP2。将重组质粒免疫小鼠,同时设立PCV亚单位疫苗、PPV灭活疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,PCV2和PPVIgG抗体效价进行了检测。结果表明,从免疫后第7d起,pCI-ORF2′-VP2免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和抗PCV2、PPV的特异性抗体效价都显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于空载体对照组,且重组质粒组在第21～42d诱导的免疫水平显著或极显著强于PPV灭活疫苗组。证实,构建的重组质粒pCI-ORF2′-VP2能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

山羊痘病毒P32基因与绵羊CD58基因共表达载体的构建及其免疫活性分析

为了增强山羊痘病毒P32蛋白的免疫效果,发挥CD58的免疫佐剂作用,将山羊痘病毒P32基因和绵羊CD58基因构建在同一载体上,转染BHK21细胞,通过直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验分别间接检测P32和直接检测CD58在BHK21中的表达。结果显示,P32和CD58在BHK21细胞中都有表达。以构建的P32基因与绵羊CD58基因共表达载体为DNA疫苗,通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,定期采血,用ELISA检测免疫抗体水平,用MTT法检测细胞免疫情况;结果表明,共表达载体可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。     

腔上囊病病毒VP2基因重组腺病毒的构建

采用RT-PCR方法扩增腔上囊病病毒(IBDV)VP2 基因,亚克隆到 pAdlox转移载体,与野生型腺病毒ψ5一起共转染Cre8细胞,将IBDV-VP2基因在5型腺病毒中进行表达。结果,获得了含有腔上囊病病毒 VP2 基因的重组腺病毒 Adv VP2,感染重组腺病毒的细胞经 Western blotting检测,得到了1个约37 ku的VP2多肽,而感染空载体病毒的细胞及对照细胞则无此蛋白条带。证实,成功构建了表达IBDV VP2基因的重组腺病毒。     

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位重组腺病毒的免疫保护性研究

为了评估联合表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因和具有免疫原性的T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE的免疫保护效果,将20头抗体和核酸均为阴性的断奶仔猪随机分为4组,包括2组免疫组、攻毒对照组和阴性对照组。2组免疫组分别免疫重组腺病毒rAd-ORF2-TCE和rAd-ORF2,2周后加强免疫1次,一免后第28天攻毒。通过PCV2特异性抗体水平的检测以及血清中和试验评估疫苗的体液免疫反应水平,通过外周血T淋巴细胞亚群的动态变化以及细胞因子分泌水平评估疫苗免疫诱导的细胞免疫反应水平。结果表明,与其他对照组比较,重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够诱导猪体产生更为强大的体液免疫和细胞免疫水平。攻毒试验结果表明,rAd-ORF2-TCE能够有效抵抗PCV2感染。本试验结果进一步证实了构建的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够有效地诱导猪产生足够的免疫保护能力。