牛分枝杆菌重组MPT83蛋白间接ELISA方法的建立

以纯化的牛分枝杆菌重组MPT83蛋白为包被抗原,建立了检测牛分枝杆菌抗体的间接ELISA方法。确定了间接ELISA各组分的最适反应条件:抗原包被浓度为1μg/mL,酶标二抗稀释度为1∶1600,血清稀释度为1∶60,抗原和血清、血清和二抗均在37℃反应30 min,底物在37℃显色15 min,D655 nm阴性、阳性临界值为0.5。经阻断试验、交叉试验、重复性试验,表明该方法特异性强、重复性好。用该方法对18份结核菌素试验阳性牛血清和36份结核菌素试验阴性牛血清进行检测,结果显示,阳性血清的符合率为27.8%,阴性血清的符合率为91.7%。     

牛分支杆菌MPT83基因的表达及重组蛋白的纯化

从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA,扩增了MPT83基因,并克隆入pMD 18-T Simple Vector,将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a( )中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化。经测序,构建的克隆质粒pMD-MPT83与Gen- Bank中的序列一致;构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamHⅠ HindⅢ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,4 h后表达量即达到高峰;Western- blotting分析表明,融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带。表明MPT83基因原核表达载体构建成功。     

伪狂犬病病毒湖北株的电镜观察及基因诊断

伪狂犬病病毒湖北株的电镜观察及基因诊断王家富丁建华张楚瑜罗满林（武汉大学生命科学院４３００７２）伪狂犬病（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）是由疱疹病毒（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）引起的多种家畜和野生动物的一种急性传染病，尤以对猪的危害最大。该病以母猪繁殖障碍...     

牛结核病巢式PCR快速检测方法的建立

根据分枝杆菌(mycobacteria)保守的插入序列IS1081设计4条特异性引物,建立了快速检测牛结核病的巢式PCR方法。该方法一次扩增的敏感性是1.35 pg,二次扩增的敏感性是1.35 fg。在对95份PPD阳性牛临床病料组织和23份血液样本的PCR检测中,用引物TB-Q1和TB-Q2做一次扩增,阳性检出率分别为36/95(37.5%)和5/23(21.7%);用引物TB-B1和TB-B2做二次扩增,阳性检出率分别为81/95(85.3%)和14/23(60.9%)。该方法作为辅助PPD试验的快速检测方法用于牛结核病的流行病学调查,具有重要的实用价值和应用前景。     

猪痢疾病原及免疫机理研究进展

猪痢疾是由猪密螺旋体引起的,以出血性和坏死性肠炎为特征的疾病(俗称为猪血痢)。8～14周龄的断奶猪易发,严重影响着养猪业的发展。本文仅就病原和免疫机理作一概述。 (一)病原 猪痢疾自Whiting(1921)首次报道以来,其病原在长达50年里一直不清,曾被怀疑的病原有沙门氏菌、螺旋体、弧菌、坏死梭杆菌、病毒、结肠小袋虫、变形虫、毛滴虫及其它原虫等。直至1971年,由Taylor和Alexander报告了一种致病性厌氧螺     

鸭白细胞介素-2基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank中登录的鸭IL-2基因序列设计并合成了1对特异性引物,以经ConA诱导的广州鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度为360 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切鉴定、PCR鉴定及序列测定结果表明,获得了鸭IL-2成熟蛋白基因的完整克隆.测序结果表明,该成熟蛋白基因由360个核苷酸组成,共编码119个氨基酸.克隆的鸭IL-2基因与GenBank上序列号为AYl73028及AF294322的鸭IL-2基因的同源性高达99.4%.将目的基因克隆至真核表达载体pPICZáC上,构建了重组质粒pPICZáC-DuIL-2.酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了鸭IL-2基因.SDs-PAGE分析证实,鸭IL-2基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达成功,表达的重组蛋白的分子质量约为14.3 ku.     

ELISA诊断猪痢疾

自1982年由L.A.Joens等报告了应用ELISA检测猪痢疾密螺旋体的抗体以来,国内除作者于1984年做了题为《应用酶联免疫吸附试验诊断猪痢疾的初步研究》(见华中农业大学学报,1988.1.)外,迄今未见有关内容报道。本文就进一步研究的有关情况和结果报告如下。 (一)材料和方法 1.超声处理抗原:按罗满林等在《华中农业大学学报,1988,1.》报道的方法进行。 2.脂多糖抗原:基本上同Joens等(1982)方法、略改进。将制成的猪痢疾密螺旋体     

云南猪场隐孢子虫分子流行病学调查及种类鉴定

作为一种人兽共患的肠道原虫,隐孢子虫可感染包括猪在内的多种家畜和人类,但对云南省猪的隐孢子虫感染情况尚缺乏系统研究。为获悉云南省猪场隐孢子虫的感染情况及其虫种类型,本研究采集来自于云南四个代表性猪场的129份新鲜粪样,采用巢式PCR扩增猪隐孢子虫的18S rRNA基因序列,然后通过序列比对分析和构建进化树,解析隐孢子虫的种属关系;对不同地区及动物年龄的感染率进行风险因素分析。结果,有17个样本确定为隐孢子虫感染阳性,总体感染率为13.18%(17/129),其中16例为成猪隐孢子虫,1例为猪隐孢子虫;风险因素分析显示,感染率在不同地区及不同的年龄段之间均有极显著的差异(P0.01)。本研究首次在云南省猪体内发现猪隐孢子虫虫种,研究结果为云南省猪隐孢子虫病的防控提供了基本数据。     

猪圆环病毒2型ORF2与T细胞表位重组腺病毒的免疫保护性研究

为了评估联合表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因和具有免疫原性的T细胞表位(T cell epitope,TCE)基因的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE的免疫保护效果,将20头抗体和核酸均为阴性的断奶仔猪随机分为4组,包括2组免疫组、攻毒对照组和阴性对照组。2组免疫组分别免疫重组腺病毒rAd-ORF2-TCE和rAd-ORF2,2周后加强免疫1次,一免后第28天攻毒。通过PCV2特异性抗体水平的检测以及血清中和试验评估疫苗的体液免疫反应水平,通过外周血T淋巴细胞亚群的动态变化以及细胞因子分泌水平评估疫苗免疫诱导的细胞免疫反应水平。结果表明,与其他对照组比较,重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够诱导猪体产生更为强大的体液免疫和细胞免疫水平。攻毒试验结果表明,rAd-ORF2-TCE能够有效抵抗PCV2感染。本试验结果进一步证实了构建的重组腺病毒rAd-ORF2-TCE能够有效地诱导猪产生足够的免疫保护能力。     

牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到了融合基因.将融合基因片段先克隆于pMDl8-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40 ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性.