猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立

根据猪链球菌16 S rDNA基因的种特异性基因序列和CPS基因的2型(1或/和2型)型特异基因序列设计了4条引物,建立了快速检测猪链球菌2型(1或/和2型)的多重PCR方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示,所建立的多重PCR方法特异、敏感,对组织中的猪链球菌2型(1或/和2型)的最低检出水平为30 CFU/mL。用所建立的多重PCR方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测,并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证,结果显示,检出阳性符合率为100%,证实建立的多重PCR方法可用于猪链球菌2型的快速检测。     

羊毛皮张和土壤中炭疽杆菌PCR检测方法的建立

建立了检测炭疽芽孢杆菌染色体特异性基因序列 (Ba813)的PCR技术 ,并用于模拟污染的羊毛、皮张和土壤中炭疽芽孢 (Sterne菌株、PasteurⅡ菌株 )的检测。结果表明 ,该方法可特异、敏感地检出 0 .5 g羊毛中Sterne菌株的 4 5 2个芽孢和PasteurⅡ菌株的 6 88个芽孢 ;0 .5g皮张中Sterne菌株的 4 5 2个芽孢和PasteurⅡ菌株的 10 32个芽孢 ;0 .5 g土壤中Sterne菌株的 4 5 2个芽孢和PasteurⅡ菌株 1376个芽孢。证实PCR可用于羊毛、皮张和土壤等外环境中炭疽杆菌芽孢的检测。     

产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)乳牛乳腺炎大肠杆菌的检测及其基因型分布

为了解采自内蒙古和上海地区的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)乳牛乳腺炎大肠杆菌的流行特点、耐药性和基因型分布,采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2005年推荐的初筛及纸片确认方法对内蒙古地区的58株和上海地区的22株乳牛乳腺炎大肠杆菌进行了ESBLs的检测及耐药性分析,并采用PCR扩增和PCR产物测序方法对产ESBLs菌株进行基因分型。结果显示,内蒙古地区检出6株产ESBLs菌株,阳性率为10.34%,其中,有1株菌携带TEM-1基因,有1株携带CTX-M-14型基因,而有3株同时携带TEM-1型和CTX-M-14型2种基因,只有1株菌未检出上述基因。上海地区未检出产ESBLs菌株。结果表明,产ESBLs菌株多表现为多重耐药,对各种抗菌药物的耐药率明显高于非产ESBLs菌株。     

大肠杆菌对氨基糖苷类药物的交叉耐药现象观察

交叉耐药性(Cross-resistance to drugs)是兽医工作者在临床实践中注意较少的问题。由于交叉耐药性的出现,使一些药物尚未在临床应用,大量菌株已有耐药性存在,而致这些药物失去使用价值。 我们在大肠杆菌(Escherichia coli)的地方菌株药敏试验中,发现地方耐药菌株中有90.7％的菌株(39/43)同时对三种以上的药物耐药。对四环素族药物同时耐药的现象十     

河南省仔猪下痢病原—致病性大肠埃希氏菌血清型的鉴定

材料和方法 (一)被检菌株 系河南省7个地区、14个县市、24个养猪场从病猪小肠内容物和粪便材料中分离的,经病原学鉴定为典型的F7—Coli致病菌株,共138株。 (二)抗血清制备 从卫生部药检所引进的国际标准菌株。按肠道致病菌大肠杆菌诊断血清制造和检定规程自制的单因子血清。经吸收试验,其特异性良好,无重要交叉反应。 (三)鉴定方法 先将被检菌分别制成O、Ok两种抗原,用各种10倍稀软的抗血清分别     

不同序列型禽白念珠菌对鸡致病性的研究

为了探究不同禽类来源和序列型(STs)的白念珠菌菌株对鸡致病力的差异,以禽源白念珠菌多位点序列分型(MLST)中三个主要克隆群Group 25、Group 26和Group 34的发源序列型(founders)ST 3221、ST 3164和ST 3226的代表株BDK7、RZ-1和BYCSF为试验菌株,分别采用嗉囊注射和颈静脉注射接种途径感染蛋雏鸡,通过观察临床症状、剖检病变、组织病理学变化和生存统计分析,比较试验菌株对鸡致病力的差异。三个试验菌株均可对蛋雏鸡致病,侵染的主要靶器官是肝脏和脾脏;嗉囊接种组鸡的总死亡率仅9.3%(7/75),远小于静脉接种组鸡的总死亡率61.3%(46/75);从试验菌株致病力的比较来看,嗉囊接种组和静脉接种组的致病力排序分别为RZ-1BDK7BYCSF和BDK7RZ-1BYCSF。研究结果表明,不同禽类来源的白念珠菌试验菌株均可使蛋雏鸡致病;不同基因型菌株间的致病力差异显著;当感染途径不同时各试验菌株表现出的相对毒力也明显不同。     

应用琼脂双相双扩散法鉴定大肠杆菌菌毛抗原

已知引起仔猪、犊牛、羔羊等幼畜腹泻的肠病原大肠杆菌株,常能产生两种致病因子,即菌毛抗原成分及肠毒素。目前用于临床鉴定分离于这些幼畜腹泻大肠杆菌株是否产生菌毛抗原的方法,主要包括有:抗D-甘露糖血凝反应、直接玻片凝集反应,反向间接血凝反应、酶联免疫吸附试验等。作者本次将琼脂双相双扩散试验用于对K_(88)_、K_(99)、987P、F_(41)菌毛抗原的鉴定,取得了可信性结果,现报告如下:(一)材料1.大肠杆菌株:用于本试验、产生菌毛抗原的4个标准菌株为:①44563,产生菌毛抗原K_(88),血清型分别包括O_8:K_(87),K_(88ac);H_(19),来源于卫生部药品生物制品检定所;②C_(83912),产生菌毛抗原K_(99),血清型别为K_(12),K_(99);③C_(83915),产生菌毛抗原987P,血清型分别为0_9:K_(103),987P:NM;④C_(83919),产生菌毛抗原F_(41),血清型分别为O_(101)∶K_(30),F_(41)∶H~-。后3个标准菌株均来源于中国兽药监察所。用于本试验、从不同动物分离的5株大肠杆菌均不产生K_(88)、K_(99)、987P、F_(41)菌毛抗原,其编号为No.1、No.2、No.3、No.4、No.5,     

腹泻羔羊中大肠埃希氏杆菌的耐药性研究

用14种药物对86株从腹泻羔中分出的E.coli进行耐药性试验。除萘啶酸外,所试菌株对其它13种药物均有耐药菌株产生。94％的菌株对P-G、ERY、TM耐受;50％的菌株对SU、COS TMP、TC、NED耐受。耐药菌株最少的药物为FUZ(1.2％)、KNA(17.4％)。所有菌株至少耐受2种药物,最多达11种。55％的菌株耐药达6种。不同地区疫群、同一疫群不同年份所分菌株对药物的敏感性也不相同。     

用表面免疫荧光法鉴定鸡源霉形体

本文报告了用表面免疫荧光法鉴定鸡源霉形体的结果。此法具有很高的特异性,能成功地用于分类鉴定的目的,并能检出培养物中混杂的霉形体种类。 (一)材料和方法 1.培养基:按Frey(1968)所介绍的配方经过适当修改后制成。 2.霉形体菌株:自国际霉形体中心Freundt教授处引进4种霉形体模式株:鸡毒霉形体(Mycoplasma gallisepticum,PG31株);雏鸡霉形体(M.pullorum,CKK株);滑液霉形体(M.synoviae WVU1853株);鸡霉形体(M.gallinarum PG16株)。新分离菌株有:从北京东沙种鸡场(DS)分离3株;从北京朝阳区十八里店公社西直河大队鸡场(XZ)分离13株;从海淀区四季青公社巴沟鸡场(BG)分离23株;从广西南宁市郊区(GX) 4个鸡场分离10株,共计49株。     

绵羊肠耶新氏菌在体内的分布及其内毒素所致病理变化

本文研究观察了在SLB 090-1株Y·e活菌液以不同 途径人工感染后,以及该菌内 毒素和经化学处理菌液接种动物后,它们所致病理变化和体内菌分布。 (一)材料与方法 1.菌株:系本研究组分离自某牧场自然患病羊的生物3型(NB_3)绵羊肠耶新氏菌,菌株代号SLB 090-1。菌种保存于血清马丁琼脂斜面,使用前经羊体传代3代。SLB 090-1株菌对兔、羊的最小致死量(MLD)分别为2亿活菌和10亿活菌(限于条件未作进一步稀释求出LD_(50))。将计量的SLB090-1菌株菌液分为3份,一份作活菌(RD)接     

鸡源大肠埃希氏杆菌的耐药性研究

本文对10个E.coli标准菌株和129个鸡源E.coli地方菌株进行了耐药性研究。发现试验菌株全部对1种或多种抗菌药物有耐药性。除对庆大霉素未产生耐药性外,所试菌株对其余13种药物均显示程度不同的耐药。其中主要对青霉素,金霉素,磺胺嘧啶,链霉素,土霉素,四环素和红霉素耐药。在139个耐药菌株中,观察到47种不同的耐药类型,大多数为多重联合耐药,其中有1个地方菌株可同时耐受11种药物。最普遍的耐药类型是青、链、嘧、土、金,青、链、嘧,妥、土、金,青,青、链、嘧,土,青、链、嘧、金和青、链、嘧、土、金、合等。试验表明,试验菌株对庆大霉素的耐药率(0)最低,但却以氯霉素的抑菌作用最强,其次为庆大霉素,痢特灵,新霉素,合霉素等。     

河北省鸡源大肠杆菌CTX-M型ESBLs基因的流行特征研究

旨在从分子水平阐明河北地区鸡源大肠杆菌CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因流行特征,探究大肠杆菌耐药性传播途径,为制定科学的防控措施奠定基础。从河北地区病鸡肝中分离大肠杆菌,通过选择性培养基培养特性观察、细菌生化试验、16S rRNA方法鉴定分离菌株;采用K-B法测定细菌的药物敏感性;通过PCR技术检测第3代头孢菌素耐药菌株中CTX-M基因(bla_(CTX-M-1)、bla_(CTX-M-2)、bla_(CTX-M-8)和blaCTX-M-9)和整合子整合酶基因(Int1、Int2和Int3)的流行情况,比对基因序列,分析携带CTX-M基因亚型的情况。参照McMLST网站数据库提供的7对管家基因序列进行MLST分型,探索不同ST型菌株中CTX-M基因亚型的流行情况。经分离鉴定试验,共检测出56株大肠杆菌,其中41株(73.21%)大肠杆菌对第3代头孢菌素类抗生素耐药,且对碳青霉烯类抗生素呈高度敏感。第3代头孢菌素耐药菌株中携带blaCTX-M-9(48.78%)、blaCTX-M-1(43.90%)和blaCTX-M-8(24.39%),未检出blaCTX-M-2。从CTX-M-9群共检出CTX-M-65(n=10)、CTX-M-14 (n=8)和CTX-M-27 (n=2)这3种基因亚型;CTX-M-55 (n=15)型在CTX-M-1群中的检出率最高,其次为CTX-M-123(n=2)和CTX-M-64(n=1);36株携带blaCTX-M大肠杆菌同时携带Ⅰ型整合子的Int1基因。MLST分型结果表明,36株携带CTX-M基因的大肠杆菌共有16种ST型,优势流行型为ST85 (n=6)和ST243 (n=6)。由此可见,河北地区鸡源大肠杆菌对第3代头孢菌素的耐药率较高,对极少数的抗生素呈高度敏感,且呈现多重耐药型,第3代头孢菌素耐药菌株普遍携带CTX-M型耐药基因,以CTX-M-55、CTX-M-65、CTX-M-14型为主。本研究结果表明,河北地区鸡源大肠杆菌普遍具有耐药性,有丰富的耐药谱型,同时多种耐药基因可存在于同一株细菌中,不同耐药基因的ST型归属特性存在差异。     

血液直接培养快速诊断兔巴氏杆菌病

(一)材料和方法 1.试验菌株:采用3株多杀性巴氏杆菌,C48—1菌株由中国兽药监察所提供,C8709(猪源)和Y8608(鸭源)菌株均系我们从自然病例分离的地方菌株,菌落荧光型,前者为Fg型,后者为FO型。 2.试验兔:系未注射过巴氏杆菌疫苗的健康家兔,体重1.5kg左右,试验前煌绿滴鼻呈阴性反应。 3.采血瓶;洁净青霉素瓶内装4～5个玻珠(直径约0.5cm),加塞后用胶布牢固固定,高压灭菌备用。     

抗鸡致病性大肠埃希氏菌O_(88)单克隆抗体的研究

用纯化的鸡致病性大肠埃希氏菌O88 菌株( MG38e) 热灭活抗原免疫BALB/c 雌性小鼠,再用该菌株粗提的脂多糖尾静脉注射加强免疫后,取其脾细胞与SP2/0 细胞融合,经有限稀释法克隆,用间接ELISA 及凝集试验(IHT) 筛选,获得4 株能稳定分泌该菌株单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞培养液ELISA 和IHT 效价分别为1∶100 ～1∶1000 和3 log2 ～4 log2 ;腹水效价分别为1∶100 ～1∶4000 和4 log2 ～10 log2 。这4 种单克隆抗体( E1 、E2 、E3 、E4) 均能与鉴定的7 株O88菌株发生凝集反应,E4 株还能与O78菌株发生凝集反应。用单克隆抗体对分离的45 株鸡致病性大肠埃希氏菌进行血清型鉴定,结果5 株为O88 ,与用单因子血清鉴定的结果一致。     

应用虎红平板凝集试验检疫奶牛布氏菌病

虎红平板凝试验(RBPT)在家畜布氏菌病检疫中,做为一种初筛方法沿用已久。一般认为,它有较强的特异性及敏感性,故有克服非特异性反应的优点。以往我们采用试管凝集试验(SAT)对健康牛群进行布病例常检疫时,常受到非特异性反应的干扰,为了解决这个问题,在1984年6月对青岛地区某场牛群进行布病检疫时,以RBPT为主要方法,同时用补体结合试验(CFT)及SAT两种方法做为比较。为了对RBPT的敏感性及特异性作出评价,还以布氏菌牛种387菌株(BA387)、布氏猪型二号菌苗(S_2)及耶尔辛氏菌0:9菌株(Ye:0.9)接种健康奶牛制备免疫血清作为对照。现简要介绍如下。     

猪源性大肠埃希氏菌对抗菌药物的敏感性测定

从甘肃省13 个地区( 州、市) 规模化猪场和专业户猪场分离出大肠埃希氏菌118 株,按世界卫生组织( W HO) 推荐的RirbyBauer 氏方法,用18 种抗菌药物对其敏感性进行了测定。结果:抑菌作用最强为诺氟沙星,高敏菌株占89 .0 % ;抑菌作用最差为四环素,耐药菌株占100 % 。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)外膜脂蛋白基因序列 ,设计合成了 1对特异性引物。经PCR扩增 ,APP 110标准血清型菌株均能扩增出大小为 980bp的DNA片段 ,而大肠埃希氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APPDNA的敏感性可达 2pg。表明 ,此PCR方法特异性好 ,敏感性高 ,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

56株食源性单增李斯特菌耐药性测定及耐药基因的检测

为调查新疆部分食源性单增李斯特菌的药物敏感性和相关耐药基因的携带现况,采用微量肉汤稀释法(MIC)和K-B琼脂扩散法对56株单增李斯特菌进行18种抗菌药物敏感性试验。通过PCR方法进行12种相关耐药基因检测,并对耐药基因进行测序分析。结果表明,28.6%(16/56)的菌株微量肉汤稀释法检测耐药,而K-B琼脂扩散法检测19.6%(11/56)菌株耐药。56株单增李斯特菌均对青霉素、氨苄西林、亚胺培能、庆大霉素、万古霉素、左氧氟沙星、利福平敏感,对四环素、复方新诺明、链霉素、强力霉素、卡那霉素耐药。微量肉汤稀释法检测发现,菌株对四环素、复方新诺明、链霉素耐药率较高,分别为12.5%(7/56)、10.7%(6/56)、10.7%(6/56),多重耐药菌株占7.1%(4/56)。在18株表型耐药菌株中,61.1%(11/18)的菌株携带相应的耐药基因,四环素类耐药基因以tetM为主,红霉素耐药基因为ermB,氯霉素素耐药基因为cat。而在38株非耐药表型菌株中,氨基糖苷类耐药基因aac(6')-Ib-cr和红霉素耐药基因ermB的检出率分别高达57.9%和39.5%。扩增片段核苷酸序列与参考序列同源性为95%～100%。新疆食源性单增李斯特菌出现耐药,且耐药表型与耐药基因不完全符合,应引起关注。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1/R1和GPVF1/R1,建立了一种PCR方法,用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果,引物MDPVF1/R1仅特异性扩增出MDPV的900 bp核酸片段,引物GPVF1/R1仅特异性扩增出GPV的465 bp核酸片段。表明,建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。