禽呼肠孤病毒σB基因在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

本研究旨在通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物学活性的禽呼肠孤病毒σB蛋白。首先,根据NCBI中ARVσB基因序列,设计引物构建σB基因重组供体质粒pFast-σB。随后转化DH10bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-σB。通过脂质体介导法转化sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-σB。将重组病毒感染sf9细胞,表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光(IFA)检测表明,ARVσB蛋白在sf9细胞中成功表达,分子量约为41 ku,并具有良好的生物学活性,为进一步研究ARVσB基因的功能及其基因工程亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒σC编码基因在sf-9昆虫细胞中的表达

采用RT-PCR方法扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因,将其克隆到pFastBacHTA载体上,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC;将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR筛选,获得重组转座子rBacmid-σC。在脂质体介导下将rBacmid-σC转染sf-9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBV-σC;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,在sf-9细胞中表达了分子质量约37 ku的σC蛋白,该蛋白能与原核表达的σC蛋白免疫小鼠血清发生特异性免疫反应,这为以表达的σC蛋白为抗原的亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒99G株σB编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

采用RT-PCR方法扩增禽呼肠孤病毒(ARV)99G株σB编码基因,序列分析表明,99G株σB编码基因与其他禽呼肠孤病毒的同源性为90%～99 9%,而与我国番鸭呼肠孤病毒S12株的同源性仅有60%;用BarnH Ⅰ和Xho Ⅰ酶将σB编码基因切下并克隆到表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-σB;鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,σB基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达的融合蛋白占总蛋白的41.46%,融合蛋白的分子质量为66 ku,主要以包涵体形式存在;Western-blot结果显示,该融合蛋白能与抗ARV阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性,可用于禽呼肠孤病毒病诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制.     

禽呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术扩增了禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株与广西分离株R2σNS非结构蛋白基因,将σNS基因克隆到质粒表达载体pGEX-4T-1上,获得的重组质粒经PCR、酶切鉴定以及测序分析,σNS基因的插入位置、大小和阅读框均正确,将阳性克隆命名为pGEX-S1133-σNS和pGEX-R2-σNS。构建好的重组质粒经37℃1 mmol/L IPTG诱导、SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,显示目的蛋白以包涵体方式表达,其蛋白质分子质量约为66.2 ku,约占菌体总量的31.5%~34.8%。Western-blotting分析表明,目的蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有较好的抗原性。     

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组(S1-4)中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明:鸭呼肠孤病毒(DRV)与禽呼肠孤病毒(ARV)的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76.0%~77.1%和78.4%~79.6%,氨基酸同源性分别为89.5%~91.2%和91.6%~92.7%;而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60.3%~64.4%和2.7%~9.9%,氨基酸同源性分别为61.4%~62.0%和22.6%~26.7%;DRV和ARV抗原性存在差异。而DRV S12/S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90.0%、93.6%、87.9%~88.0%和93.1%,氨基酸同源性分别为97.1%、94.3%、95.7%~95.9%和93.7%。进化树分析表明,DRV与ARV形成不同的分支,DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。     

禽呼肠孤病毒σA基因对鸡胚成纤维细胞天然免疫相关基因转录水平的调控影响

为了明确禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)σA基因对宿主天然免疫应答的影响,本研究利用实时荧光定量PCR方法检测pCAGEN-σA转染鸡胚成纤维细胞(DF1)后,不同时间点(转染后第3、6、12、24和36小时)DF1细胞中天然免疫相关基因,包括Toll样受体(TLRs)、MDA5、MAVS、My D88、TRIF、IRF-3、IRF7、NF-κB、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、IFITM3、Mx1和OASL等基因的转录水平变化。结果,与空载体转染细胞相比,pCAGEN-σA转染细胞中上述这些天然免疫基因的m RNA水平出现不同程度变化(P0.05或P0.01)。TLR3应对最快速,其m RNA水平在转染后第3小时和第6小时迅速上升,但9 h后逐渐下降;MDA5和TLR7的m RNA水平,则分别在转染后第6小时和第12小时开始显著升高,并分别在转染后第12小时和第36小时达到峰值(P0.05或P0.01);TLR15的m RNA水平整体变化不明显。My D88和MAVS的m RNA水平呈表达上调趋势;TRIF在转染后第6小时表达量迅速达到峰值(2.83倍),随后急速下降。NF-κB呈表达上调趋势;而IRF3/7的表达则被抑制。I型干扰素(IFN-α和IFN-β)呈现相似的表达模式,在转染后第6小时和第24小时表达量增加,其他时间点均为表达量下降; IL-6和IL-8则表达上调,分别在转染后第9小时和第6小时达到峰值(P0.01)。IFITM3、Mx1、OASL的m RNA水平也显著升高,均在转染后第12小时达到峰值(P0.01)。上述试验结果表明,在DF-1细胞中过表达σA基因,能显著引起天然免疫相关基因的表达的变化,为进一步阐释ARV的分子致病机制和免疫应答机理奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒感染鸡胚成纤维细胞后三种细胞因子基因mRNA转录水平的动态变化

为了分析禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)对细胞产生的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影响,并探讨禽呼肠孤病毒的感染机制及病毒与宿主之间的作用关系,运用实时荧光定量RT-PCR技术,测定和分析了ARV-S1133感染CEF细胞后ARV结构蛋白σC和IL-1β、IL-6、TNF-α的动态转录水平。结果显示,ARV-S1133感染CEF后第10小时起病毒σC基因mRNA的相对表达量开始迅速上升,在第48小时达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量发生变化,这3个基因mRNA的表达变化趋势相似。IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA转录水平在感染早期迅速上升,在感染后第6小时达到第1个峰值,随后下降,在感染中后期再次显著上升,在第48小时达到第2个峰值。IL-1β、IL-6、TNF-α在感染后第6、24、36和48小时的mRNA转录水平与对照组差异极显著(P0.01)。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-1β、IL-6、TNF-α的水平上调,进而发生炎症反应,说明IL-1β、IL-6、TNF-α可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。     

禽呼肠孤病毒σNS基因的克隆及其功能分析

采用RT-PCR技术对8株禽呼肠孤病毒(ARV)σNS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与pMD18-T载体连接。测序结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应的σNS蛋白基因,大小为1 107bp。经DNAStar软件分析,除R1株外,其他ARV毒株的σNS基因核苷酸及其推导氨基酸序列与标准毒株S1133和1733株的同源性很高。Antheprot 5.0蛋白分析软件的分析结果表明,σNS蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,可作为诊断候选蛋白。     

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒(ARV)P17非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV S1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0.2 mmol/LIPTG诱导,表达的融合蛋白分子质量为42.4 ku,占菌体总蛋白的34%。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后,纯度达到85%。Western-blotting显示,纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应,说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。     

禽呼肠孤病毒感染后Toll样受体在SPF鸡不同器官中的表达变化

为了探明Toll样受体(TLRs)在禽呼肠孤病毒(ARV)感染致病过程中的作用,本研究考察ARV感染鸡的不同器官中TLRs在不同感染时间点的动态表达变化。本研究将ARV S1133毒株经足垫注射,接种7日龄SPF鸡,感染后第1、3、5、7和14天采集鸡脾、腔上囊、胸腺、肝和心脏等器官组织,利用荧光定量PCR方法检测TLR3、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21在这些器官中的m RNA表达水平变化,分析ARV感染对鸡不同器官中上述TLRs m RNA表达量的影响。结果表明,ARV可诱导TLR3、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21在不同器官中的表达,并且表达变化也不同。在免疫器官中以TLR3和TLR7的表达升高为主,在心脏和肝中以TLR7和TLR15的表达为主。这些结果提示,TLR3、TLR5、TLR7、TLR15和TLR21在ARV感染致病过程中发挥不同的作用,本研究结果为进一步阐明禽呼肠孤病毒的致病机理奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒S1133株在LMH细胞系中增殖特征的研究

为研究禽呼肠孤病毒(ARV)在鸡肝癌细胞(LMH)中的增殖特性,本研究将ARV S1133毒株感染LMH细胞,连续传代3次,观察细胞病变(CPE),通过RT-PCR鉴定病毒,并进一步研究病毒的增殖特性。结果显示,ARV S1133毒株能够在LMH细胞中很好地增殖,并出现典型的CPE。一步生长曲线结果显示,S1133感染LMH细胞后的前12 h为潜伏期,12 h~24 h为快速增长期,第24小时的效价达到最大,TCID50为10-9.2/0.1 m L。本研究为进一步研究ARV的致病机理和研制细胞灭活疫苗提供了良好的操作平台。     

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立禽呼肠孤病毒(ARV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切,得到线性化转录模板DNA,将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板,用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物,以体外转录的RNA作为标准品,应用SYBR GreenⅠ染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,比常规的RT-PCR敏感1×103倍,可检测到5.2×102个拷贝的标准品RNA,与NDVI、BDV、MG均不反应;从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒,病毒含量为1×105~1×107个拷贝/μL。表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于ARV的检测。     

以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立

将鸭呼肠孤病毒小外壳σC蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,获得了重组质粒pET32a-σC,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞后,经SDS-PAGE和Western-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应;以0.15 mmol/L IPTG诱导,5 h后融合蛋白σC表达量可达高峰,分子质量为50ku;融合蛋白纯化后被用作包被抗原,建立了检测鸭血清中呼肠孤病毒抗体的间接ELISA,经对检测条件优化,最佳包被浓度为5μg/mL,标准阳性血清的最适稀释倍数为1∶40。用该方法对50份鸭血清样品进行了检测,与琼脂扩散抗体检测法相比,ELISA具有良好的特异性和敏感性。     

利用重组慢病毒载体共表达Cas9-sgRNA构建TLR4基因敲除DF1细胞系

Toll样受体4(TLR4)是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖(LPS)和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染禽DF1细胞。流式细胞仪分选、测序验证了在家禽DF1细胞系成功敲除了TLR4基因。然后利用GV393慢病毒表达载体,构建了CAG启动子启动Cas9的共表达载体Lv-CAG-Cas9-U6-sg RNA。通过转染、流式分选、培养单细胞克隆、靶基因组测序以及Western-blot检测,筛选获得1株TLR4基因敲除的DF1细胞系。结果表明,TLR4基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。本研究验证了共表达Cas9和sg RNA可以在禽源细胞系实现基因编辑,为利用重组慢病毒共表达Cas9和sg RNA策略探索构建敲除鸡模型研究奠定了理论基础和科学依据,也为研究禽TLR4基因功能、家禽天然免疫应答机制提供了细胞模型。     

蓝舌病毒VP6蛋白的原核表达及抗体制备

本试验首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病毒1型(BTV1)的VP6基因,然后将其克隆到表达载体pPRoEx-HTb上,构建重组表达质粒pPro-VP6,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后用IPTG诱导表达,优化表达条件,纯化重组表达的VP6蛋白,免疫新西兰白兔制备抗VP6蛋白的多克隆抗体,利用Western-blot和细胞免疫荧光试验检测抗体的特异性及VP6蛋白在BTV1感染细胞中的分布。结果显示,重组VP6蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,利用组氨酸标签纯化树脂获得了高纯度的VP6蛋白;制备的抗VP6多克隆抗体不仅可与重组表达的VP6蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然VP6蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞中检测到了VP6蛋白的特异表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组VP6蛋白并制备了相应的特异抗体,为进一步揭示VP6蛋白的特性和功能奠定了基础。     

野鸭源新城疫病毒V蛋白基因在DF-1细胞中的表达及V蛋白的亚细胞定位

为研究野鸭新城疫病毒V蛋白基因在真核细胞中的表达及V蛋白的亚细胞定位,将新城疫病毒V基因片段与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-V重组表达质粒,经脂质体转染DF-1细胞后,用Western-blot验证该基因在DF-1细胞中的表达;用激光共聚焦显微成像技术确定V蛋白在真核细胞中的分布及亚细胞定位。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-V在外源真核细胞DF-1中获得了表达,表达蛋白主要聚集于细胞质。研究结果为进行野鸭源新城疫病毒V蛋白的功能研究奠定了基础。     

马流产沙门菌鞭毛重组蛋白FliC的原核表达及对小鼠的免疫保护试验

为研究马流产沙门菌新疆分离株鞭毛蛋白FliC(flagellin C)的免疫生物学特性及保护特性。本研究利用PCR技术扩增获得该菌的Fli C基因,并将其连接到原核表达载体p ET-28a(+)上,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,用IPTG诱导表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western-blot检测与分析表达蛋白,并将纯化的重组蛋白免疫小鼠。结果显示,成功诱导表达了52 ku的重组蛋白,该蛋白第2次免疫小鼠第14天时血清中的特异性Ig G抗体效价可达1∶72 900,且抗体亚型以Ig G1为主,免疫小鼠的攻击保护率可达73%。结果表明,Fli C重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫保护效果。为进一步开展马流产沙门菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

新型鸭呼肠孤病毒TH11株在BHK21细胞系中的增殖特性

为研究新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)在BHK21细胞系中的增殖规律,将NDRV野毒株TH11接种BHK21细胞系,连续传代3次后,观察病毒对细胞的致病变效应(CPE),并对病毒核酸及其蛋白的表达和病毒增殖特性进行了鉴定。结果显示,NDRV TH11株能够在BHK21细胞中有效增殖,并产生以细胞巨融合为主的典型CPE,病毒蛋白在细胞中也获得了良好表达,并与σC蛋白特异性抗体发生反应。一步生长曲线显示,TH11毒株感染BHK21细胞后第0~12小时为潜伏期,第12小时开始增殖,第12~36小时进入快速增殖期,第48小时病毒效价即达到最高,即TCID50为106.57/0.1mL,随后病毒的增殖随细胞的崩解而降低。上述结果为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞灭活疫苗奠定了基础。     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞后病毒复制及TLR3诱导表达的影响

本试验旨在探索猴头菇多糖(HEP)对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染RAW264.7细胞中病毒复制及TLR3诱导表达的影响,为进一步解析HEP在调节MDRV所致的番鸭机体免疫抑制中的作用机制提供数据参考。本试验首先通过测定HEP在小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)上的安全浓度的基础上确定HEP的添加浓度;然后通过RT-qPCR方法和Western-blot方法分别检测各组细胞中TLR3 m RNA的转录水平和TLR3、病毒σNS的蛋白表达量,从基因和蛋白的分子层面分析HEP对MDRV感染RAW264.7细胞的免疫调节作用。结果显示:HEP在46.88～187.5μg/m L浓度范围内是可以促进RAW264.7细胞生长,浓度为93.75μg/m L时细胞相对增殖率最高,VCG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)高于BCG组,HPG与HTG细胞TLR3 m RNA的相对表达量和蛋白表达量均极显著(P0.01)低于VCG组。结论:HEP可从基因与蛋白水平抑制MDRV感染早期过度活化的TLR3的表达,从而起到抗病毒作用。     

Cd~(2+)致线粒体损伤在rPT细胞凋亡中作用的研究

为探讨镉(Cd~(2+))致线粒体损伤在大鼠原代肾小管上皮细胞(r PT)凋亡中的作用,本研究对r PT细胞施以不同浓度梯度的Cd~(2+)经不同时间长短处理,并以添加PARP-1的抑制剂DPQ、抗氧化剂NAC处理作为对照处理,应用Western-blot的方法检测细胞中线粒体相关蛋白的表达,用免疫荧光的方法检测不同处理组中细胞凋亡率和线粒体膜电位的变化。结果显示,Cd~(2+)促进PARP-1蛋白的表达以及AIF和Cyt C从线粒体中释放;抑制PARP-1蛋白的活性后显著下调细胞凋亡率并且使线粒体膜电位恢复到相对正常水平;与Cd~(2+)组相比,Cd~(2+)+NAC处理组中相关促凋亡蛋白表达下降而抑凋亡蛋白表达增加,同时降低了细胞凋亡率,线粒体膜电位也恢复到相对正常水平。以上结果表明,Cd~(2+)使r PT细胞发生线粒体损伤以及氧化应激并且诱导细胞凋亡,其中PARP-1/AIF信号通路在这一过程中发挥了重要作用。