禽呼肠孤病毒σNS基因的克隆及其功能分析

采用RT-PCR技术对8株禽呼肠孤病毒(ARV)σNS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与pMD18-T载体连接。测序结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应的σNS蛋白基因,大小为1 107bp。经DNAStar软件分析,除R1株外,其他ARV毒株的σNS基因核苷酸及其推导氨基酸序列与标准毒株S1133和1733株的同源性很高。Antheprot 5.0蛋白分析软件的分析结果表明,σNS蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,可作为诊断候选蛋白。     

番鸭呼肠孤病毒σNS蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-YB-σNS。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功高效表达出分子质量约为58ku的融合蛋白。该融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在,表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度、诱导温度分别为4h、1mmol/L和37℃。通过对包涵体和可溶性蛋白进行尿素洗涤纯化和(或)Ni 2+柱亲和层析纯化,得到了高纯度的重组蛋白。分别对纯化前、后的重组蛋白进行Western-blot分析,结果显示两者均可以与MDRV阳性血清发生特异性反应,表明它们具备良好的反应原性。将纯化后的可溶性σNS蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶32 000。上述研究结果为后续MDRVσNS蛋白功能研究奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒99G株σB编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

采用RT-PCR方法扩增禽呼肠孤病毒(ARV)99G株σB编码基因,序列分析表明,99G株σB编码基因与其他禽呼肠孤病毒的同源性为90%～99 9%,而与我国番鸭呼肠孤病毒S12株的同源性仅有60%;用BarnH Ⅰ和Xho Ⅰ酶将σB编码基因切下并克隆到表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-σB;鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,σB基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达的融合蛋白占总蛋白的41.46%,融合蛋白的分子质量为66 ku,主要以包涵体形式存在;Western-blot结果显示,该融合蛋白能与抗ARV阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性,可用于禽呼肠孤病毒病诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析。结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B。再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1。经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21(DE3)(pLysS)感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白。用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性。     

禽呼肠孤病毒σB基因在杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

本研究旨在通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达具有生物学活性的禽呼肠孤病毒σB蛋白。首先,根据NCBI中ARVσB基因序列,设计引物构建σB基因重组供体质粒pFast-σB。随后转化DH10bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-σB。通过脂质体介导法转化sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-σB。将重组病毒感染sf9细胞,表达重组蛋白。通过SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光(IFA)检测表明,ARVσB蛋白在sf9细胞中成功表达,分子量约为41 ku,并具有良好的生物学活性,为进一步研究ARVσB基因的功能及其基因工程亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒YB株NS基因的序列分析及原核表达

为实现番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株NS非结构基因的克隆分析及原核表达,首先经RT-PCR扩增NS基因的完整编码序列(CDS),并将其克隆到p ET-32a(+)载体中。测序后对获得的NS基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。测序结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株NS基因的原核重组质粒p ET-YB-NS,并获取了NS基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB NS基因的CDS大小为1 908 bp,编码635个氨基酸;该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为98.2%~99.4%。遗传进化树分析显示,MDRV-YB株处于传统型MDRV分支上。该蛋白氨基酸序列中并不含有潜在的信号肽序列,但是含有2个潜在的N-糖基化位点以及61个磷酸化位点。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,成功高效表达出分子质量约为88.7 ku的融合蛋白(p-NS),表达时IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为5 h、0.4 mmol/L和36℃。Western-blot结果显示,表达的p-NS蛋白能特异性识别MDRV阳性血清,表明表达产物具备良好的反应原性。上述结果表明,MDRV NS非结构基因的克隆分析及其蛋白表达的实现,为进一步研究MDRV NS蛋白功能奠定了基础。     

鸭源H9N2亚型流感病毒NS基因的克隆及表达

根据GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的NS基因序列设计合成了 1对引物NSU/NSL ,利用RT PCR扩增出了H9N2株NS基因 ;将该基因片段克隆到 pMD 18 T载体上 ,并对所得到的重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果 ,获得了NS基因片段的阳性重组子 ,扩增的NS基因包含NS1基因完整的阅读框架和部分NS2基因 ,其序列与GenBank中收录的其他分离株NS基因比较 ,同源性达 96 %～ 99%。再将克隆的NS基因插入到原核表达载体 pET 2 8a后 ,转化E .coliBL2 1(DE3)感受态细胞 ,在IPTG诱导下获得了预期的蛋白表达 ,所表达蛋白质的分子质量约为 30ku。     

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒(ARV)P17非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV S1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0.2 mmol/LIPTG诱导,表达的融合蛋白分子质量为42.4 ku,占菌体总蛋白的34%。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后,纯度达到85%。Western-blotting显示,纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应,说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。     

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。     

犬瘟热病毒R/20-8株核衣壳蛋白基因的克隆和表达

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒(CDV)核衣壳(N)蛋白基因的高度保守序列,将其克隆至质粒pMD18-T中,获得了重组质粒pMD18-T-N。将N基因的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21株,经IPTG诱导,N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE电泳和Western-blot分析结果显示,表达产物的分子质量为55 ku,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。表明,大肠杆菌表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有一定的相似性,可作为诊断用抗原。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

利用RT PCR技术 ,用包容口蹄疫病毒完整VP1基因的引物从口蹄疫分离株 (China/99 2 )中扩增得到一约 75 0bp的DNA片段 ,克隆后 ,经对该片段的核苷酸序列进行测序和同源性比较 ,显示其与国外同源参考序列 (O1K/66)的同源性为 80 .44% ,与国内同型参考株 (HB/WH/99)的核苷酸序列的同源性达 99.0 6%。随后以重组质粒pGEM VP1为模板 ,用特异性表达引物扩增得到目的基因VP1 (65 0bp) ,对目的基因和表达载体 pGEX 4T 1分别以相同的限制性内切酶酶切后构建成重组表达载体 ,转化宿主菌BL2 1 (DE3 )后得到重组质粒pGEX VP1 ,经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序证明目的基因正确插入到表达载体。用IPTG诱导VP1基因的表达 ,收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳、Western blotting分析检测。结果表明 ,结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中表达 ,表达产物的分子量约为 5 3ku ,并能被口蹄疫阳性血清所识别。经薄层扫描分析 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .0 0 %。证明口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中高效表达 ,且表达产物有一定的生物学活性     

番鸭呼肠孤病毒σC编码基因在sf-9昆虫细胞中的表达

采用RT-PCR方法扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因,将其克隆到pFastBacHTA载体上,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC;将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR筛选,获得重组转座子rBacmid-σC。在脂质体介导下将rBacmid-σC转染sf-9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBV-σC;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,在sf-9细胞中表达了分子质量约37 ku的σC蛋白,该蛋白能与原核表达的σC蛋白免疫小鼠血清发生特异性免疫反应,这为以表达的σC蛋白为抗原的亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

新城疫病毒F蛋白免疫活性片段的原核表达

利用已构建的新城疫病毒F基因重组质粒,通过氨基酸序列分析和InsightⅡ基因工作站的MODELER程序和同源模建技术,预测了试验株F蛋白的表面抗原分布位置.设计引物扩增了2段含有多个抗原位点的多肽片段,通过双酶切定向克隆到原核表达载体pET32a,获得了重组质粒pET32a-F1和pET32a-F2以及2个片段串联起来后克隆的重组质粒pET32a-F3.重组质粒经诱导表达并取产物进行分析,结果显示,F1、F2、F3片段均获得了融合表达.Western-blotting证实,表达产物F1、F2和F3与NDV阳性血清均具有免疫反应性.用表达的重组蛋白加免疫佐剂经皮下接种免疫鸡,免疫2次后产生较高的抗体水平,用100 LD50的超强毒株GD-05-2攻击,重组蛋白免疫组鸡可达到约70%的保护率,并可显著抑制排毒.     

番鸭呼肠孤病毒YB株μA基因的克隆分析与原核表达

为了对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)μA基因进行克隆分析和原核表达,本研究设计了1对特异性引物,对MDRV-YB株的μA基因进行RT-PCR扩增,扩增产物经过双酶切后克隆到p ET-32a(+)载体中,经测序验证成功后,将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。随后对表达产物进行SDS-PAGE以及W estern-blot分析。结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株A基因的原核重组质粒,并获取了A蛋白的基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB株μA基因CDS大小为2 199 bp,负责编码732个氨基酸,该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为83.8%~99.7%,与新型鸭源呼肠孤病毒(NDRV)的同源性约为82.5%,与鹅源呼肠孤病毒(GRV)同源性为80.9%,而与禽(鸡源)呼肠孤病毒(ARV)的同源性仅为73.1%;进化树分析μA基因的结果显示,MDRV-YB株属于传统型呼肠孤病毒,该蛋白氨基酸序列中无潜在的信号肽序列,6个潜在的N-糖基化位点以及45个磷酸化位点;SDS-PAGE分析表明,目的蛋白为分子质量约为99.7 ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其IPTG最佳诱导温度为33℃,浓度为0.8 mmol/L,时间为6 h;Western-blot结果显示,表达的目的蛋白能与抗MDRV阳性血清发生特异性反应,表明其具备良好的反应原性。本研究为进一步探索MDRV μA蛋白功能奠定了基础。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出A群猪轮状病毒(PRV)G5型OSU株长度约为1.0kb的基因片段,将其克隆到pMD 18-T载体上进行测序鉴定,证明为该PRV的VP7蛋白基因,与已发表的该PRV VP7基因序列的同源性为99.8%.将该基因黏端克隆至表达载体PblueBAChisC质粒中,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV-VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子.纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5 d后收获重组病毒.通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定,确定PRV-VP7基因已正确插入.将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后,获得了重组杆状病毒PRV-VP7蛋白的真核表达.     

无血凝性兔出血症病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大肠杆菌内的高效表达

分离出1株在4、25、37℃条件下均不能凝集人"O"型红细胞的兔出血症病毒(RHDV),命名为SQ-1株;采用RT-PCR扩增获得病毒主要结构蛋白VP60蛋白基因,并对目的基因进行测序及分析;将目的基因定向克隆入原核表达载体pET-30a的多克隆位点,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,纯化重组蛋白,用Western-blot检测其反应原性。测序与同源性分析结果显示,该毒株属于RHDV抗原遗传变异株(RHDVa),所扩增的VP60基因的ORF为1 740bp,编码579个氨基酸残基,与世界上其他RHDV毒株的核苷酸序列的同源性为89.9%～98.0%,与已报道的无血凝特性的病毒株whn-1株及低血凝性的Rainham株的核苷酸序列的同源性分别为95.2%及90.8%。重组质粒经IPTG诱导后目的基因获得表达,重组蛋白与预期大小一致,分子质量约为60ku,主要以包涵体形式存在。Western-blot检测证实,纯化蛋白能够与RHDV阳性血清发生良好的杂交反应,说明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

禽呼肠孤病毒σC蛋白的真核表达及亚细胞定位的初步分析

本研究根据GenBenk中σC的序列设计特异性引物,通过PCR扩增σC基因,构建真核表达载体pEF1α-HA-σC,转染DF1细胞,在DF1细胞中表达ARVσC蛋白。结果显示,成功在DF1细胞中表达ARVσC蛋白,大小约为37 ku,Western-blot分析表明,表达的蛋白具有良好的反应原性,激光共聚焦显微镜观察发现在DF1细胞中表达的σC蛋白定位于细胞质中。本研究为今后深入研究σC蛋白在ARV感染过程中的功能和在ARV天然免疫中的具体调控机制奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组(S1-4)中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明:鸭呼肠孤病毒(DRV)与禽呼肠孤病毒(ARV)的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76.0%~77.1%和78.4%~79.6%,氨基酸同源性分别为89.5%~91.2%和91.6%~92.7%;而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60.3%~64.4%和2.7%~9.9%,氨基酸同源性分别为61.4%~62.0%和22.6%~26.7%;DRV和ARV抗原性存在差异。而DRV S12/S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90.0%、93.6%、87.9%~88.0%和93.1%,氨基酸同源性分别为97.1%、94.3%、95.7%~95.9%和93.7%。进化树分析表明,DRV与ARV形成不同的分支,DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。     

流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增,得到了1条完整的基因,大小为642 bp;测序分析证明,它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约50 ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Western-blotting试验证明,表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。