犬猫的恶性组织细胞瘤和淋巴瘤的病理学诊断

采用WHO肿瘤最新分类方法,对临床上犬和猫的恶性组织细胞瘤及淋巴瘤进行病理学分析。通过石蜡切片的常规染色(HE染色)、免疫组织化学方法及基因重排等方法进行组织学鉴定。1例病犬的病理学检查结果为肿瘤细胞核仁明显,体积较大,免疫组织化学结果 Vim、Lys、CD68及α-抗糜蛋白酶(α-AT)呈阳性;对CK、EMA及S-100呈阴性,依据2013版WHO对软组织肿瘤最新分类方法该病例被诊断为中间性恶性纤维组织细胞瘤;根据免疫组化及Ig H基因重排分析,依据2008版WHO造血及淋巴组织分类标准另1例病犬诊断为皮肤非亲皮性淋巴瘤。3例病猫的病理学检查结果分别为:1例经细胞标记的免疫组化分析,Vim、Lys呈强阳性,被诊断为恶性纤维组织细胞瘤;1例经免疫组化分析CD3、颗粒酶B和MPO均为阳性,诊断为慢性嗜酸粒细胞白血病;经免疫组化分析Pax5、CD79a为阳性表达,CD3、Ig G为阴性表达,结合2008年WHO造血及淋巴组织分类鉴别为结外黏膜相关淋巴组织边缘带B细胞淋巴瘤。     

犬五种典型肿瘤的病理学诊断

本研究分别对5例犬类恶性肿瘤进行病理学分析。通过石蜡切片的HE染色及免疫组织化学方法进行病理学诊断及分析。疑似甲状腺癌病犬的病理组织学观察发现甲状腺癌细胞的体积比正常细胞大,存在包膜和血管侵犯。免疫组织化学结果显示TG、Galectin-3阳性,而CT呈免疫阴性,判定肿瘤内甲状腺滤泡癌;疑似恶性神经鞘瘤病犬的病理组织学观察神经组织可见波浪状,梭形细胞界限不清浅染,核细长间深染。免疫组织化学结果显示S-100、波形蛋白、GFAP、NSE和巢蛋白呈较强阳性表达,确诊为恶性外周性神经鞘瘤;疑似脑膜瘤病犬的病理组织学观察发现,脑膜瘤右叶硬膜下增厚,出现巨细胞,核异形、深染,发现小型结节有钙化斑,PSA染色阳性。免疫组织化学结果显示Vim呈较弱阳性表达,S-100呈阳性表达,结蛋白阴性,最后确诊为脑膜瘤(颗粒细胞型);疑似甲状腺癌病犬的病理组织学观察发现甲苯胺蓝染色后呈阴性且CD117、HLA-DR呈阳性表达,初步诊断为造血细胞源性恶性肿瘤;疑似肾母细胞瘤病犬的病理组织学观察发现肺转移组织发现类似胚胎肾小球、肾小管组织。GFAP、NF阴性表达,CD10、CK、Vim和SMA为阳性表达,确诊为肾母细胞瘤。     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

免疫鸡群发生马立克病的诊断与病理学研究

采用琼脂扩散试验、PCR和病理组织学观察分别对疑似马立克病(MD)病鸡进行确诊和病理学研究。结果显示,琼脂扩散试验中马立克病病毒(MDV1)抗原呈阳性;PCR扩增出567bp的MDV1特异性片段。病理学观察显示,肝、脾、肾和心程度不等肿大,色泽变淡,形成有大小不等和数量不一的灰白色结节。部分病鸡坐骨神经呈单侧性不规则肿粗,弹性降低或丧失。病鸡实质器官及坐骨神经组织中均出现大量多形态的类似淋巴细胞、成淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞及网状细胞的肿瘤细胞聚集和散在,并可见典型的MD细胞,尤其在血管周围和淋巴管周围。各型肿瘤细胞和MD细胞异型性明显,肿瘤细胞周围实质程度不等的变性、坏死,间质水肿。核仁区嗜银蛋白染色结果显示,肿瘤细胞增生活跃,恶性程度较高。     

旋毛虫ES抗原致小鼠骨髓源树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶表达的影响

为探讨旋毛虫排泄分泌(ES)抗原体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC2.4)在不同时间点对吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达情况,将ES抗原(终浓度为15?g/mL,试验组)、重组小鼠IFN-γ(浓度为1 000 U/mL,阳性对照组)和RPMI 1640培养液(阴性对照组)加入到状态良好的树突状细胞中,并设无添加的空白对照组,分别刺激0、2、6、12、24 h后收集细胞,采用细胞免疫组织化学方法检测各组树突状细胞IDO的表达情况,实时荧光定量法检测各组IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αmRNA表达水平,W estern-blot方法检测各组IDO蛋白表达水平。结果显示,ES抗原、IFN-γ均能提高IDO在细胞质中的mRNA及蛋白表达水平,且与空白对照组呈显著性差异(*P0.05,*P0.01,***P0.001);随着刺激时间的增加,IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αm RNA及IDO蛋白表达量均显著上升,且与空白对照组呈显著性差异(***P0.001)。结果证实,ES抗原可刺激树突状细胞表达IDO,且存在一定的时间效应,可能与旋毛虫逃避宿主的免疫有一定关系。     

禽骨髓细胞瘤病自然病例的病理学研究

对禽骨髓细胞瘤病显性型病鸡、ELISA阳性的隐性型病鸡和阴性对照鸡进行了病理学研究。结果表明 ,临床症状明显的显性型病鸡肝、脾、肾、睾丸 (或卵巢 )、肺等组织有灰白色结节状病灶和不同程度的肿胀 ,甚至在股骨或肋骨等处出现大小不一的硬固肿块 ,镜检病变部位有大量髓细胞样瘤细胞 ,呈典型的骨髓细胞瘤病的病理特征。电镜下瘤细胞病变明显 ,瘤细胞胞膜下疑似病毒样粒子 ;在自然病例肾悬液感染的鸡胚成纤维细胞培养物中巨噬细胞的膜性结构上发现增殖的病毒样凸起。ALV JELISA抗体检测试剂盒检出阳性、无明显临床症状和眼观病变的隐性型病鸡 ,光镜下骨髓、肝、卵巢、心肌等组织中可见与显性型相同的髓细胞样瘤细胞 ,但数量较少。ELISA抗体检测阴性对照鸡骨髓中胞浆含有嗜酸性颗粒的髓细胞明显少于阳性鸡 ,除在肝、卵巢等组织中偶尔出现外 ,其他组织很少见到。     

山羊成骨细胞的体外培养和鉴定

采用初生山羊羔股骨骨膜,通过植块培养法、完全消化法和半消化植块法分离、培养成骨细胞。结果表明,植块培养法、完全消化法和半消化植块培养法的贴壁时间分别为4、24、4 h;培养4 d时的细胞数量分别为少量细胞、少量细胞、大量细胞,细胞汇合时间分别为21、19、10 d。传代后第7 d即可汇合,第14 d出现矿化结节,茜素红染色呈橘红色,Von Kossa染色呈黑色;姬姆萨和HE染色后可见体外培养的细胞呈三角形、多角形,胞质丰富,胞核卵圆形,单核,有1~3 个核仁;碱性磷酸酶染色后胞质呈黑色颗粒或块状沉淀;扫描电镜观察胞突发达,伸出的突起与临近细胞的突起相连。体外培养传至15代时细胞的生物学性状未发生变化。试验结果显示,半消化植块培养周期短,细胞损害小,有利于细胞贴壁,是一种可行的骨组织工程研究方法。     

宁夏肉用种鸡J亚群禽白血病的实验室诊断

对宁夏某肉用种鸡场发病的肉种鸡病料进行组织病理学检查 ,并将其接种于鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,从中分离到J亚群禽白血病病毒 (ALV J)。从患鸡肝组织切片中观察到大量髓细胞样瘤细胞 ,散在或呈簇状 ,髓细胞样瘤细胞的细胞质内显现嗜酸性颗粒。在用抗ALV J囊膜糖蛋白的单克隆抗体进行的间接荧光抗体 (IFA )试验中 ,病料接种CEF后的IFA试验呈现强阳性。用一对ALV J特异性的引物对病料基因组DNA进行PCR扩增 ,结果 ,扩增出了 2 .2kb的特异性条带。上述观察和试验证实 ,该肉用种鸡场肉种鸡发生的疫病为J亚群禽白血病     

贵州省山羊痘病例的病原学鉴定与病理学观察

为对近年来发生在贵州省部分地区疑似山羊痘的疫情做出确诊,取疑似山羊痘病羊皮肤及黏膜痘疹,处理后接种Vero-E6细胞,可观察到明显的细胞病变;反向间接血凝试验显示,细胞培养液血凝效价为22~25,阳性率达100%(5/5);以山羊痘病毒P32基因的1对特异性引物,从9份痘疹样本(共10份)及2株分离株PCR扩增出963 bp的特异性DNA条带;取感染细胞培养物接种成年健康山羊,山羊出现了典型的临床症状和病理变化,接种10日龄鸡胚绒毛尿囊膜也能表现出明显的痘斑病变,痘斑出现率可达40%;病羊上皮细胞呈不同程度的水泡变性,胞浆内含多量嗜酸性包涵体;细胞内存在圆形或卵圆形、有囊膜、大小约为310 nm×204 nm的病毒粒子。结果表明,近年来发生在贵州省部分地区的山羊疫情是山羊痘所致。     

乳鼠成骨细胞的培养及鉴定

无菌采取5日龄SD大鼠的颅盖骨,用胰蛋白酶预消化后,漂洗,剪碎,再用Ⅱ型胶原酶消化获得成骨细胞。通过倒置相差显微镜观察,并用碱性磷酸酶和矿化结节染色鉴定,利用微量滴定(MTT)法测定一个培养周期的成骨细胞活性分布,探讨一种经济、高效的原代成骨细胞培养方法。倒置相差显微镜形态观察结果显示,未贴壁的细胞呈圆形,贴壁生长的细胞呈不规则梭形、三角形或多角形,单核,有1~3个核仁;碱性磷酸酶和钙化结节染色均呈阳性(阳性率≥98.06%);MTT法结合形态学观察结果显示,成骨细胞培养至第10 d时活性最强。证实用改良的二次酶消化法能够在短时间内获得大量成骨细胞,且所培养的细胞具有典型的成骨细胞形态和功能。     

CREB对添加食欲素A体外培养的绵羊卵巢黄体化颗粒细胞分泌孕酮的影响

为探讨食欲素A(orexin A)影响绵羊卵巢颗粒细胞分泌孕酮是否受环磷酸腺苷(cAMP)及其下游环磷酸腺苷效应原件结合蛋白(CREB)的调节,体外培养绵羊卵巢颗粒细胞并进行姬姆萨染色、卵泡刺激素受体免疫荧光染色鉴定后,采用细胞免疫组化手段对CREB的存在及位置做出确定。经黄体化处理后分组添加不同浓度(10 nmol/L、100 nmol/L、1 mol/L)的食欲素A受体阻断剂(HY-10805A)孵育2 h,再添加不同浓度(10 nmol/L、58 nmol/L)的食欲素A,运用ELISA方法检测细胞内cAMP浓度的变化。在细胞培养液里添加不同浓度(100 nmol/L、1 mol/L、10 mol/L)的CREB抑制剂(HY-101120)孵育2 h,后添加相同浓度(10 nmol/L)的食欲素A,运用ELISA方法检测细胞培养上清液中孕酮的浓度。结果显示,姬姆萨染色后,可见长梭形或不规则星形卵巢颗粒细胞,细胞着色均匀,胞浆淡蓝色,细胞核深蓝色。免疫组化试验组细胞形态清晰,胞核呈黄色,胞浆无染色。添加食欲素A受体阻断剂组与对照组相比,cAMP的浓度显著降低(P0.01),不同浓度CREB抑制剂组与对照组相比,孕酮含量均下降,且下降趋势在其浓度为10 mol/L时达到最高(P0.01)。结果表明,绵羊卵巢颗粒细胞中存在CREB,且浓储于细胞核,外加食欲素A可影响绵羊卵巢颗粒细胞cAMP的含量,而在阻断其下游原件CREB后,孕酮分泌明显受到影响,说明CREB对绵羊卵巢颗粒细胞的孕酮分泌有影响。     

食欲素A对绵羊卵巢颗粒细胞分泌孕酮以及cAMP含量的影响

为了解食欲素A对绵羊卵巢颗粒细胞分泌孕酮以及cAMP浓度的影响,通过食欲素A刺激体外培养的绵羊卵巢颗粒细胞,采用HE染色和免疫荧光观察促卵泡激素受体(folicle-stimulating hormone receptor,FSHR)蛋白表达的方法进行鉴定,并经黄体化处理,添加不同浓度(1 nmol/L,10 nmol/L,58 nmol/L,100 nmol/L或145 nmol/L)的食欲素A分别处理0、24、48、72 h收取细胞上清,运用ELISA方法检测细胞培养上清液孕酮浓度。结果表明,HE染色后镜下可见梭形或不规则星形的卵巢颗粒细胞,细胞核呈深蓝色,胞浆呈淡粉色。免疫荧光结果显示FSHR呈阳性表达,细胞纯度达90%以上。绵羊卵巢黄体化颗粒细胞添加食欲素A,同一时间孕酮分泌量随食欲素浓度的增加呈逐渐升高然后下降的趋势,且添加浓度在10 nmol/L时孕酮分泌量达到最高;添加同一浓度的食欲素A,随着作用时间的延长孕酮分泌量呈逐渐升高然后下降的趋势,且时间在24 h时分泌量达到最高。在进一步的研究中,体外培养绵羊卵巢颗粒细胞,经黄体化处理,添加不同浓度的食欲素A受体阻断剂(HY-10805A)(10 nmol/L,100 nmol/L,1 mol/L)孵育2 h,添加不同浓度(10nmol/L,58 nmol/L)的食欲素A孵育24 h收取细胞上清,运用ELISA方法检测细胞裂解上清中cAMP浓度变化。结果表明:添加食欲素受体阻断剂组与对照组相比c AMP的浓度显著降低(P0.01)。以上结果说明绵羊卵巢颗粒细胞分泌孕酮受食欲素A的浓度及时间变化影响,并且能够影响细胞中cAMP的含量。     

贵州省禽白血病病毒J亚群感染的血清学检测与PCR鉴定

采用禽白血病J亚群抗体检测试剂盒对8个鸡场的血清样本进行了检测,并对出现肿瘤病变的病死鸡进行了病理组织学检查;同时采集16份禽白血病病毒J亚群(ALV-J)抗体阳性鸡的血液或肝组织,提取DNA样本进行PCR扩增,并测序分析.结果显示,4个肉种鸡场的ALV-J抗体阳性率平均为16.52 %(3.33%～30.0%),而4个蛋种鸡场的ALV-J抗体阳性率均为0.病理组织学观察可见,在肝、肾、脾组织中出现大量增生的、含嗜酸性颗粒的髓细胞样瘤细胞.PCR检测发现,有14份样本扩增出ALV-J亚群特异性的病原核酸片段(545 bp),检出率达87.5%,其中在3份肝样本中同时扩增出ALV-A亚群特异性的病原核酸片段(691 bp);而ALV-J抗体阴性鸡、淋巴细胞性白血病和血管瘤型白血病的20份样本均未扩增出545 bp片段.扩增出的545 bp片段与ALV-J亚群毒株HPRS-103和ADOL-HcL的相应核苷酸序列的同源性分别达96.2%～96.8%和95.5%～96.8%.结果证实,贵州省鸡群中确实存在ALV-J亚群感染和骨髓细胞瘤病,且出现A亚群、J亚群混合感染的情况.