胸膜肺炎放线杆菌抗体ApxⅣ-Dot-PPA-ELISA检测方法的建立

本研究构建了胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素ⅣA(ApxⅣA)的原核表达质粒pET-28a(+)-ApxⅣ,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为48ku的ApxⅣ蛋白,经Western-blot分析表明该重组ApxⅣ蛋白具有反应原性。试验进一步用纯化的重组ApxⅣ蛋白作为抗原,建立了胸膜肺炎放线杆菌抗体的Dot-PPA-ELISA检测方法,该方法诊断膜片上点样ApxⅣ抗原质量为0.737μg,该方法检测灵敏度高,可检测到胸膜肺炎放线杆菌标准阳性血清IgG的最低含量为8.374×10-9 g;检测特异性好,不与副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、猪链球菌2型、多杀性巴氏杆菌、日本脑炎病毒的阳性血清发生交叉反应。应用建立的诊断方法对446份临床血清样品进行检测,胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性检出率为25.37%。结果表明,该方法具有操作方便、灵敏、结果易于判读等优点,可应用于猪场猪传染性胸膜肺炎的血清学诊断。     

放线杆菌外膜蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活与毒性检测

为了筛选胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白在肺泡上皮细胞上的作用受体,应用酵母双杂交技术构建诱饵质粒载体pGBKT7-omp(胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白),从胸膜肺炎放线杆菌提取基因组DNA,用PCR方法获得omp,克隆于pGBKT7载体上,进行酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-omp在酵母双杂交系统中的自激活和毒性作用。结果表明,成功构建了诱饵质粒载体pGBKT7-omp,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。表明pGBKT7-omp可应用在酵母双杂交系统中,用于寻找猪肺泡上皮细胞cDNA文库中与omp相互作用的蛋白质。     

猪胸膜肺炎放线杆菌分裂体形成相关基因的分析

猪胸膜肺炎放线杆菌细胞分裂的形态利用扫描电镜进行观察。根据文献报道收集细菌细胞分裂体形成的相关基因信息;应用BLAST、Smart和Pfam软件和GenBank中的有关序列,分析参与猪胸膜肺炎放线杆菌分裂体形成相关基因;根据GenBank中已报道的DNA序列设计Fts基因家族基因的引物,以App血清1型基因组为模板经PCR扩增有关基因片段并测序,再通过序列比对进行同源性分析。结果,猪胸膜肺炎放线杆菌细胞分裂主要发生在细胞中部,参与分裂体形成的相关基因有24种,其中Fts家族基因包括FtsZ,FtsB、FtsL、FtsH、FtsW、ZipA、FtsE、FtsX、FtsQ和FtsA共10种,这些基因在不同的血清型有很高的同源性。但未发现与FtsZ聚合相关的MinC、MinD和MinE。结果表明,猪胸膜肺炎放线杆菌的细胞分裂主要发生在细胞中部,分裂体形成机制与其他细菌存在差异。     

猪胸膜肺炎嗜血杆菌血清Ⅰ型菌溶血素的生产条件

猪胸膜肺炎嗜血杆菌(H.pleuropneumon-iae)又叫猪胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropne-umoniae)是引起猪的传染性胸膜肺炎的病原,各种年龄的猪均可感染,尤以3月龄仔猪受害最为严重,已成为各国集约化养猪场的主要危害之一。据报道,该菌有12个血清型,而以血清Ⅰ型菌毒力最强。当前预防本病尚无有效的方法,有人用灭活的猪胸膜肺炎嗜血杆菌溶血素预防本病,取得较佳效果。为提高本菌溶血素的产量,本试验对猪胸膜肺炎嗜血杆菌血清Ⅰ型菌溶血素的生产条件进行了如下探索。 (一)材料和方法     

应用NaOH制备胸膜肺炎放线杆菌菌影方法的建立

将培养12、24、48和72 h的胸膜肺炎放线杆菌血清1型shope菌株的菌液浓度分别调至1×10~8和1×10~9CFU/m L,测定氢氧化钠(NaOH)对其最小抑菌浓度;将不同培养时间、2种浓度的菌液与对应的最小抑菌浓度NaOH混合,37℃孵育75 min;间隔取样,对细菌形态学、裂解情况进行观察,确定制备菌影的条件。结果显示,NaOH对各培养时长、2种浓度的胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌液均有裂解效果,37℃作用75 min,均未能检测到活菌,裂解率可达到100%。通过扫描电镜观察发现,细菌菌体形态完好、外膜孔道明显。结果表明,用NaOH成功地制备了胸膜肺炎放线杆菌菌影,这种新型制备菌影的方法安全、高效,为日后该菌菌影疫苗的生产与应用奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

通过实验室检验 ,从福建省 2个送检猪场猪的肝、脾病料中分离出 2株猪胸膜肺炎放线杆菌 ,结合临床表现 ,推断它们均具有较强的致病性     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)外膜脂蛋白基因序列 ,设计合成了 1对特异性引物。经PCR扩增 ,APP 110标准血清型菌株均能扩增出大小为 980bp的DNA片段 ,而大肠埃希氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APPDNA的敏感性可达 2pg。表明 ,此PCR方法特异性好 ,敏感性高 ,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

氟苯尼考混悬乳注射液对人工感染胸膜肺炎仔猪的药效学研究

为观察氟苯尼考混悬乳注射液对人工感染胸膜肺炎仔猪的疗效,选用体重8～10kg的杜×长×大三元杂交猪60头,分成6组,每组10头。除健康对照组之外,其他各组猪均滴鼻接种传染性胸膜肺炎放线杆菌菌液(1×109CFU/mL)5mL。人工接种后,用氟苯尼考混悬乳注射液肌肉注射治疗,观察并记录接种后各组猪临床表现,连续观察15d。对死亡猪剖检并取肺、肝涂TSA平板培养,检查是否有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,同时用标准血清进行血清学鉴定。试验结束后对存活猪称重,计算增重率。结果表明,肌肉注射20mg/kg剂量氟苯尼考混悬乳注射液,3d1次,连用2次,对治疗猪传染性胸膜肺炎具有显著的疗效。     

贵州某猪场胸膜肺炎放线杆菌血清5型的分离鉴定

2020年11月贵州毕节某猪场一头经产母猪突然发病死亡,为鉴定导致其发病死亡的致病菌,试验无菌采取病死猪病变肺组织,通过细菌分离培养、染色镜检、生化试验、16S rRNA PCR扩增等方法进行鉴定,并对分离菌进行药敏试验、血清型鉴定、毒素基因鉴定、耐药基因检测及毒力试验。结果显示,从病变肺中分离到1株病原菌,分离菌的菌落形态、菌体形态、生化特征和16S rRNA基因序列均与胸膜肺炎放线杆菌相符,将其命名为APP GZBJ2020;药敏试验显示,APP GZBJ2020株对头孢曲松、头孢哌酮、青霉素等9种药物敏感,对头孢氨苄和米诺环素中度敏感,对庆大霉素、红霉素、新霉素等9种药物耐药;血清型鉴定结果显示其为血清5型胸膜肺炎放线杆菌;毒素鉴定结果显示APP GZBJ2020株含有ApxⅠ、ApxⅡ及ApxⅣ三种毒素基因;耐药基因检测结果显示,APP GZBJ2020株携带有tem、gyrB、parC和parE四种耐药基因;动物毒力试验结果显示,APP GZBJ2020株对小鼠有致病性。试验成功从病死经产母猪病变肺中分离到1株血清5型胸膜肺炎放线杆菌,试验结果可为该猪场治疗发病猪提供一定帮助,并为了解胸膜肺炎放线杆菌在贵州省的流行血清型提供数据支持。     

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ A基因3'端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法.筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果.结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠.应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率.     

胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株体内外培养转录差异的研究

为揭示胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株在体内外培养转录的差异,将该菌培养至对数期采用滴鼻的方式攻毒SPF级昆明小鼠,取小鼠肺组织及菌体纯培养物采用Illumina Hi Seq2500高通量测序平台对该菌在体内外培养的转录差异进行转录组测序(RNA-Seq)分析。结果显示,小鼠肺组织中获取该菌的Clean reads与指定参考基因组的比对效率达15.68%,体外培养菌体的比对效率为97.99%;以后者转录组为对照,共筛选出差异表达基因(DEG)333个,其中上调基因113个,下调基因220个,挖掘新基因6个。对DEG进行GO、COG及KEGG等分析可见,DEG主要富集在能量的产生与转化、碳水化合物转运和代谢、无机离子转运与代谢、氨基酸转运与代谢等方面,主要集中在碳代谢、ATP结合蛋白转运蛋白、嘌呤代谢、氨基酸的生物合成、硫代谢等通路上。本研究对胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株在SPF昆明小鼠体内及体外培养转录差异进行了分析,一定程度上揭示了该菌的致病机制,为后续胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株致病机制的研究提供了依据。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定

猪胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacilluspleuropneu moniae ,APP )可引起猪以纤维素性肺炎为主要特征的传染性胸膜肺炎 ,该病具有高度传染性 ,是规模化养猪场猪的主要呼吸道疾病。APP自 195 7年由英国的Pattison首次报道以来 ,现已广泛存在于世界各养猪国家 ,且各年龄的猪均易感。在我国 1990年杨旭夫正式报道了APP的存在 ,近年来其流行日趋严重 ,给养猪业造成了较大损失。1　流行及发病情况据笔者所在院校兽医门诊病例资料统计显示 ,猪传染性胸膜肺炎以秋冬季多发 ,2～ 4月龄的幼龄猪最易感染发病。 2 0 0 3年 11月～ 2 0 0 4年 3月该病…     

胸膜肺炎放线杆菌感染对猪肺及肺门淋巴结抗氧化功能的影响

将24头健康DLY(杜洛克×长白×约克夏)仔猪按性别、体重随机分为2组,采用鼻腔喷雾法分别接种生理盐水(对照组)和含3.8×107 CFU/mL胸膜肺炎放线杆菌的稀释液(试验组),研究了猪感染胸膜肺炎放线杆菌48h后血清及肺组织抗氧化功能的变化。结果显示,试验组血清中SOD、CAT的含量极显著低于对照组(P<0.01);GSH-Px、MDA含量极显著高于对照组(P<0.01);-OH含量显著高于对照组(0.010.05)。试验组肺组织除CAT含量显著高于对照组(0.01相似文献   

抗菌肽HJH-1对猪胸膜肺炎放线杆菌形成生物被膜的影响

细菌的生物被膜是病原微生物产生耐药性、免疫逃逸和造成持续感染的重要因素之一。为了解抗菌肽HJH-1对猪胸膜肺炎放线杆菌形成生物被膜的影响,本研究采用微量测定法结合扫描电子显微镜技术来评价HJH-1对APP生物被膜的作用。结果显示,与对照组相比,添加浓度为100 g/m L的抗菌肽HJH-1后,在培养APP至第48小时形成的生物被膜的数量显著减少,说明HJH-1能显著抑制APP的生长(P0.05);扫描电子显微镜的检测结果也显示,HJH-1在50 g/m L时APP形成的生物被膜变薄,细菌的间隙增大,HJH-1在100 g/m L时可明显抑制APP形成生物被膜;小鼠肺炎模型研究结果也发现,皮下注射HJH-1(20 mg/kg)可以有效减轻APP所引起的肺部炎症性反应。本研究结果为猪胸膜肺炎放线杆菌的治疗提供新的思路,也为抗菌肽HJH-1的临床应用提供了理论基础。     

上海市猪胸膜肺炎的血清学调查

于上海地区随机采集281头份大小猪血清,测定了胸膜肺炎补体结合试 验抗体。除抗补体外,264头份中64头份(24.24％)有阳性抗体。以胸膜肺炎放线 杆菌的血清型(S)计,共检测了2652型次,型的抗体平均阳性率为3.05％。其中 主要为S_5b、S_4、S_(10)和S_2,分别为9.47％,5.81％,4.65％和4.55％。随机抽检屠宰猪血清的抗体阳性率,北郊为5.789％,显然高于南郊的15.39％(P<0.01)。     

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌 (APP) 7型的DNA提取物中扩增出大小为 2 873bp的APXⅡA基因片段 ;将PCR产物重组到质粒载体 pMD 18 T中 ,并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明 ,克隆片段为完整的目的基因 ,该片段的核苷酸序列与国外分离株M 30 6 0 2的同源性达 99.7%。     

猪传染性胸膜肺炎三价灭活疫苗的研究--菌种选择、疫苗制备及安全性试验

以国内多发的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 (APP) 1、3、7血清型强毒株作为制苗菌株 ,制成油佐剂三价灭活苗。经效力试验 ,对上述 3种血清型强毒攻击的保护率分别为 88.8%、88.8%和 10 0 % ;试验动物安全性检验及田间安全检验 ,除个别猪出现轻微体温反应及暂时减食外 ,无其他异常反应。表明该苗对猪的保护性及安全性良好     

胸膜肺炎放线杆菌感染对猪血液生化指标的影响

将24头健康DLY仔猪按性别、体重随机分为2组,采用鼻腔喷雾法分别接种生理盐水(对照组)和含3.8×107 CFU/mL胸膜肺炎放线杆菌(APP)的稀释液(试验组),研究了APP感染对猪血液生化指标的影响。血液生化指标由Airone-200RA全自动生化分析仪检测。结果显示,与对照组猪相比,试验组猪血清中TP含量略有升高(P>0.05),GLB含量极显著升高(P<0.01),ALB含量、A/G值极显著下降(P<0.01);ALT、AST活性升高,其中AST活性升高极显著(P<0.01),而LT/ST值下降显著(P<0.05);IBIL、TBIL浓度及IB/DB值极显著升高(P<0.01),DBIL浓度略有下降(P>0.05);BUN、CRE浓度均略有升高(P>0.05);GLU浓度、AKP活性极显著下降(P<0.01),Ca浓度及Ca/P值极显著下降(P<0.01),P浓度显著升高(P<0.05)。结果表明,胸膜肺炎放线杆菌感染引起了猪严重的肝功能代谢障碍,血糖和血钙显著下降,肾排泄负荷增加。     

猪传染性胸膜肺炎的诊治

猪传染性胸膜肺炎的诊治马立功（山东省文登市米山兽医站２６４４２４）于诗鹏（文登市文城镇兽医站）孙广彦刘家玉杨相毕（文登市畜牧中心猪传染性胸膜肺炎，亦称猪嗜血杆菌胸膜肺炎，是猪的一种高度致死性传染病，尤其在规模养猪场多见。１９９５年春天，我市某猪场曾发...     

猪四种呼吸道病原菌四重PCR检测方法的建立与应用

为建立可同时快速检测猪支气管败血波氏杆菌(Bb)、副猪嗜血杆菌(Hps)、胸膜肺炎放线杆菌(App)和多杀性巴氏杆菌(Pm)的四重PCR方法,根据Bb的fla基因、Hps的16S rRNA基因、App的apxⅣ基因和Pm的特异性基因KMT1设计4对特异性引物,基于TaKaRa公司的Premix Taq PCR预混酶,对四重PCR的引物浓度和退火温度进行优化,确定该四重PCR的反应体系和反应条件,通过对特异性及同一种病原菌不同血清型检测的通用性、敏感性和重复性评价,建立快速检测猪这4种呼吸道病原菌的四重PCR方法,同时应用该方法对81份临床样本进行检测,检测结果与这4种病原菌单项PCR检测以及4种病原菌的分离鉴定结果进行比较。结果表明,该方法能同时对这4种病原菌进行检测,特异性和通用性好、重复性好,对这4种病原菌DNA的最低检测质量浓度为20 pg/L,对这4种细菌的最低检出量分别为1×10~3CFU/mL的Pm,1×10~2CFU/mL的Hps、Bb和App,敏感性高。81份临床样本的四重PCR检测结果和单项PCR检测结果一致,PCR检出率明显高于细菌分离鉴定结果。本研究成功建立了可同时检出猪支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的四重PCR方法,该方法可用于临床样本的快速检测以及这4种病原菌的鉴别检测。