胞内劳森菌实时荧光RPA方法的建立及初步应用

本研究基于胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)16S rRNA基因保守序列,设计特异性引物和exo探针,建立了一种能够快速检测胞内劳森菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增方法(real-time RPA)。进一步对real-time RPA方法的特异性和灵敏性进行了分析,对临床疑似病例的猪粪便和回肠样品进行了检测,并同real-time LAMP和real-time PCR检测结果进行了比较。结果表明,该方法能够在39℃等温条件下,20 min内实现对胞内劳森菌的有效检测;所建立的方法特异性强,仅对L.intracellularis产生特异性扩增,对其他常见引起猪腹泻的病原均无扩增;灵敏性高,以L.intracellularis基因组DNA为模板,检出限为1.4×10~2fg/μL;在60份临床样品中,该方法对L.intracellularis的检出率为66.7%(40/60),同real-time LAMP和real-time PCR方法一致。本研究所建立的real-time RPA方法反应快速、特异性强、灵敏性高,可用于猪场胞内劳森菌的快速检测。     

快速检测犬瘟热病毒的实时荧光RPA方法的建立

针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,并进行了敏感性和特异性试验,建立了CDV实时重组聚合酶等温扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测方法。结果表明,该实时荧光RPA方法在39℃恒温反应25 min能特异性扩增目的基因,与其他犬病毒以及CDV同属的麻疹病毒均未出现交叉反应;该检测方法具有与RT-PCR一致的敏感性;通过对CDV阳性犬的组织样品、体表样品和不同时期分离鉴定的临床样本的检测,证实建立的实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样25 min内即可判读结果,可满足CDV快速检疫的需要。     

重组酶聚合酶扩增技术结合胶体金试纸条检测新城疫病毒方法的建立及应用

本研究旨在根据鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus）F基因序列,利用Oligo 7设计RPA引物以及nfo探针,建立快速检测新城疫病毒的结合胶体金试纸条的RPA检测方法。在试验中,对探针浓度、引物浓度、反应温度、反应时间进行了优化;并将检测结果与荧光RT-PCR商品化试剂盒的检测结果进行了比较。结果显示,本方法采用50μL体系,37℃20 min即可对新城疫病毒F基因进行快速检测。该方法灵敏度高,特异性强,重复性好,检测结果与荧光RT-PCR商品化检测试剂盒检测结果一致,为养殖场检测新城疫病毒提供了一种简便可靠的检测方法。     

塞内卡谷病毒荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术建立快速检测塞内卡谷病毒(SVV)的实时荧光RT-RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,能准确检测SVV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测SVV核酸浓度为1.35×10~(-3)g/mL;简便快速,反应时间小于20 min;重复性好。利用所建立方法对116份临床样品进行检测,结果与实时荧光RT-PCR一致。本研究为SVV防控提供了一种快速检测的新方法,可用于基层实验室对SVV的快速检测。     

犬副流感病毒实时荧光RPA检测方法的建立

为快速监控犬猫科动物中犬副流感病毒(CPIV)的感染情况,本研究针对CPIV核衣壳蛋白基因的保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了CPIV实时荧光重组酶聚合酶等温扩增方法(real-time RPA)。结果表明,该方法具有良好的特异性,与其他犬病毒和同属的副黏病毒均未出现交叉反应;其敏感性与RT-PCR方法相近;将该方法应用于CPIV感染犬的临床组织样本、体表样本的检测,证实该实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA方法检测周期仅30min即可完成结果判读,满足了犬猫科动物CPIV快速检测的需要。     

家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测家畜嗜衣原体,选取家畜嗜衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因的高度保守区域,设计特异性引物和探针,通过对反应条件的优化,建立家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的最低检测限为2.8×10copies/μL,在2.8×102~2.8×106 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其标准曲线方程为y=-3.281 5x+41.396,线性相关系数r2=0.999 4,扩增效率为101.7%;该方法可特异性检测家畜嗜衣原体,对肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体等6种动物衣原体无交叉反应,特异性好;其批间重复试验和批内重复试验的变异系数分别为0.170 2%~0.467 2%、0.331 4%~2.796%,重复性良好。采用本试验建立的方法与OIE推荐的方法进行比较,二者的结果表现出良好的符合率。该方法的建立为家畜嗜衣原体的早期检测和流行病学调查提供了有效的检测手段。     

产单核细胞李氏杆菌RPA-LF快速检测方法的建立

为建立一种基于侧流层析的重组酶聚合酶扩增技术(RPA-LF)的快速检测产单核细胞李氏杆菌的方法,以该菌溶血素基因hly为靶序列设计用于RPA试验的引物及探针。利用筛选到的引物和探针对RPA反应进行优化,结果表明RPA反应可在25～45℃较大温度范围内进行,10～25 min即可完成,其扩增产物在试纸条上仅需5 min即可获得检测结果。因此,在最佳反应温度(37℃)和最佳反应时间(15 min)条件下,RPA-LF总反应时间为20 min。该检测方法不与其他12种常见的食源性病原微生物发生交叉反应,对产单核细胞李氏杆菌基因组的最低检测限可低至400 pg。本研究中建立的产单核细胞李氏杆菌的RPA-LF检测方法具有检测时间短,反应灵敏,特异性好,结果直观,无须昂贵仪器等优点,可为后期产单核细胞李氏杆菌的现场检测应用打下坚实基础。     

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10~2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10～20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。     

非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组中序列保守稳定的B646L基因设计特异性引物和探针,建立了敏感、特异、高效的ASFV核酸RPA快速检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测ASFV核酸,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等灭活病毒核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到2×101copies/uL;检测时间短,15 min即可完成反应;重复性好。采用ASFV灭活抗原和猪血液制备模拟临床猪血样品,能检出灭活抗原的稀释度为1∶12 800,应用该方法对200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血进行检测,结果均为阴性,与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。本研究建立的RPA快速检测法操作简便,尤其适合ASFV现场快速检测。     

副猪嗜血杆菌和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种特异性鉴别副猪嗜血杆菌(Hps)和猪鼻支原体(Mhr)的检测方法,对Hps的P2蛋白基因和Mhr的P37蛋白基因分别设计了1对引物,建立Hps和Mhr双重PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度试验,同时应用所建立方法对临床样品进行检测。结果显示,该方法可特异性检测出Hps和Mhr,对其他细菌无非特异性扩增,检测灵敏度可达到100 copies;并可根据扩增产物的大小区分Hps P2蛋白基因的Ⅰ和Ⅱ两个基因型,初步判定Hps的致病性。对32份呼吸道疾病临床样品的检测结果显示,Hps和Mhr阳性率分别为59.4%和53.1%,双重感染的样品为34.4%。表明,成功建立了一种灵敏、特异和快速的双重PCR方法,实现了Hps和Mhr的同时、快速、准确诊断。     

传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的建立及其应用

为建立一种用于快速检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的逆转录环介导等温扩增技术(RTLAMP)方法,设计了针对VP1基因保守序列的5组引物,采用荧光检测试剂通过实时浊度仪监测阳性扩增结果。结果显示,从5组引物中筛选出了1组对IBDV有效扩增的引物,利用该引物能够在63℃、1 h条件下实现IBDV VP1基因片段的特异性扩增,与其他病毒的核酸无扩增反应;样品RNA的最低检出量为5×10-5ng/L;利用建立的检测方法对14份临床样品进行检测,其阳性检出率为100%。结果表明,建立的IBDV RT-LAMP检测方法具有快速、准确、特异性强、灵敏度高和便捷的特点,可用于IBD临床样品的检测。     

A型动物流感病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用注

根据A型流感病毒M基因核苷酸序列设计引物及探针,建立了一种灵敏度高、特异性强、检测迅速、操作简便的重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)。选用常见动物疫病病原验证引物探针的特异性,设计多对引物及探针,筛选出最适反应体系及反应条件,并与实时荧光RT-PCR方法比较。结果显示,本研究建立的RT-RPA方法特异性强,只有A型动物流感病毒呈阳性,其他相关常见病原均为阴性;反应时间短,检测反应所需时间仅20 min;灵敏度高,最低可检测到A型动物流感病毒核酸浓度为0.96×10~(-2)μg/mL。与实时荧光RT-PCR方法相比,其灵敏度稍低。本研究建立的检测A型动物流感病毒的RT-RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,检测快速,适合现场检测以及在基层实验室推广应用。     

A型动物流感病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用

根据A型流感病毒M基因核苷酸序列设计引物及探针,建立了一种灵敏度高、特异性强、检测迅速、操作简便的重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)。选用常见动物疫病病原验证引物探针的特异性,设计多对引物及探针,筛选出最适反应体系及反应条件,并与实时荧光RT-PCR方法比较。结果显示,本研究建立的RT-RPA方法特异性强,只有A型动物流感病毒呈阳性,其他相关常见病原均为阴性;反应时间短,检测反应时间仅需20 min;灵敏度高,最低可检测到A型动物流感病毒核酸浓度为0.96×10-2g/mL。与实时荧光RT-PCR方法相比,其灵敏度稍低。本研究建立的检测A型动物流感病毒的RT-RPA方法特异性强,灵敏性高,操作简单,检测快速,适合现场检测以及在基层实验室推广应用。     

猫传染性腹膜炎病毒实时荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立一种高效准确检测猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的实时荧光定量PCR方法,以FIPV N基因为靶基因设计特异性探针和引物,构建质粒标准品。通过优化反应条件,建立real-time PCR方法,并进行临床检测。经方法优化,所建立方法的标准曲线为y=-3.137x+42.243,R²值为0.999,扩增效率E为108.0%。该方法与猫瘟病毒(FPV)、猫疱疹病毒(FHV)和猫杯状病毒(FCV)无交叉反应,特异性良好;检测最低拷贝数为9.250 copies/μL,比常规PCR方法高出100倍;组内、组间变异系数均小于5.0%,重复性好。采用建立的方法和EvaGreen real-time PCR方法对39份临床样品进行检测,结果,检出阳性样品数分别为24和22,经Kappa检验,两者高度一致。上述结果表明,本研究成功建立了高效、敏感、特异的实时荧光定量PCR方法,可用于FIPV的临床病例检测。     

病毒性出血败血症病毒实时荧光RT-RPA恒温检测方法的建立

为建立一种简单、快速的病毒性出血败血症病毒(VHSV)检测方法,本研究通过比较分析VHSV N基因的保守序列,设计了多对引物和一条探针。经过筛选优化,建立了实时荧光RT-RPA检测方法。该方法在39℃恒温反应20 min即可快速、特异性地检测出VHSV,与其他水生动物病毒不发生交叉反应,该方法检测限为1.83×10^3PFU/mL,利用本研究方法对30份鲑鳟鱼临床样品以及9份鱼类疫病病原样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。上述结果表明,本研究建立的检测方法操作简单,反应灵敏,结果可靠,仪器依赖性低,适用于现场对VHSV快速检测。     

猪嵴病毒RPA快速诊断方法的建立和应用

根据Gen Bank中公布的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)基因组序列,设计并合成特异性引物,构建阳性质粒标准品,以阳性标准品为模板建立猪嵴病毒的重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法,并对此方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒为模板时均未检测到特异性扩增条带,表明该方法具有良好的特异性;用3.36×10~7、3.36×10~6和3.36×10~5copies/μL三个不同浓度的质粒标准品进行重复试验,均能扩增出特异性条带,表明该方法具有良好的重复性。10倍梯度稀释质粒标准品,此方法检测的最低限度为3.36×102copies/μL的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对208份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示,猪嵴病毒阳性率为73.1%,明显高于常规RTPCR的46.6%,两种方法的符合率为90.2%。上述结果表明,本研究建立的RPA方法可应用于猪嵴病毒的临床诊断及快速检测。     

猪嵴病毒RPA快速诊断方法的建立和应用

根据Gen Bank中公布的猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)基因组序列,设计并合成特异性引物,构建阳性质粒标准品,以阳性标准品为模板建立猪嵴病毒的重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法,并对此方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪德尔塔冠状病毒、口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒为模板时均未检测到特异性扩增条带,表明该方法具有良好的特异性;用3.36×10~7、3.36×10~6和3.36×10~5copies/L三个不同浓度的质粒标准品进行重复试验,均能扩增出特异性条带,表明该方法具有良好的重复性。10倍梯度稀释质粒标准品,此方法检测的最低限度为3.36×10~2copies/L的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对208份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示,猪嵴病毒阳性率为73.1%,明显高于常规RT-PCR的46.6%,两种方法的符合率为90.2%。上述结果表明,本研究建立的RPA方法可应用于猪嵴病毒的临床诊断及快速检测。     

绵羊痘病毒和山羊痘病毒实时荧光重组酶聚合酶检测方法的建立

为建立一种快速、敏感鉴别诊断绵羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(G TPV)的方法,本研究根据SPPV和GTPV基因组保守区,分别设计特异性引物和探针,建立了SPPV和GTPV实时荧光RPA (real-time fluorescent recombinase polymerase amplification)检测方法。结果显示,该方法仅对SPPV和GTPV的靶基因扩增呈阳性,而对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、传染性脓疱病毒(O RFV)、蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、水疱性口炎病毒(VSV)、A型口蹄疫病毒(FM DV type A)、O型口蹄疫病毒(FMDV type O)、亚洲1型口蹄疫病毒(FMDV Asia 1)等相关病毒检测结果均为阴性,特异性良好;对SPPV和GTPV检测的灵敏度分别为4.72×10~2copies/μL和4.35×10~2 copies/μL;利用该方法对临床样品进行检测,与OIE推荐的普通PCR检测结果符合率为100%。结果表明,建立的SPPV和GTPV实时荧光RPA方法灵敏、快速、特异性强,为SPPV和GTPV感染的早期诊断提供了技术支持,适用于SPPV和GTPV的检疫、疫情监测及流行病学调查,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。     

山羊支原体山羊肺炎亚种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp),选择Mccp arc D基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立并优化反应体系,以Mccp和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为模板,进行普通PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测,并对该方法的敏感性和重复性进行评估。同时利用该方法对68份山羊临床样本进行检测。结果显示,仅Mccp有扩增条带(185 bp)和明显的荧光扩增信号(Ct值为21.93),其余供试菌株没有扩增条带,且表现出微弱的荧光扩增信号(Ct值均大于31)。普通PCR检测的灵敏度为5.96×104copies/L,而TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的灵敏度为5.96 copies/L。Ct值在组内和组间重复的变异系数均小于1%。对68份山羊临床样本进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测,结果有2份为Mccp阳性样本,阳性率为2.94%。本研究建立了一种特异、敏感、稳定可靠的Mccp TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可用于Mccp的快速诊断和定量检测,为山羊传染性胸膜肺炎的防控提供了有效的技术手段。     

阿卡斑病毒荧光RT-RAA快速检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速检测阿卡斑病毒(AKAV)的分子生物学检测方法,本研究通过比较分析AKAV基因组序列,在S基因保守序列区域设计重组酶介导等温扩增(RAA)引物及探针,筛选最佳引物对,然后对RAA反应温度、引物浓度以及探针浓度进行优化,建立了AKAV的荧光逆转录重组酶介导的核酸等温扩增(RT-RAA)快速检测方法。结果显示,所建立的荧光RT-RAA方法在42℃反应20 min即可快速检测出AKAV,检测下限可达6.26×10¹copies/μL,与牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等无交叉反应,并具有良好的重复性。对37份临床样品进行检测,阳性检出率为43.24%,与RT-qPCR检测结果符合率为94.59%。结果表明,建立的AKAV荧光RT-RAA快速检测方法具有快速、特异、灵敏、稳定等特点,可为AKAV的现场快速检测提供可靠方法。