猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

牛病毒性腹泻病毒基因1型全基因组的测序分析

以我国新疆地区分离的1株牛源牛病毒性腹泻病毒基因1型毒株为研究对象,参照GenBank中的牛病毒性腹泻病毒1型基因组全序列,根据保守序列设计6对重叠引物,通过RT-PCR扩增出该毒株不同的cDNA片段,分别克隆到pMD19-T载体,转化受体菌JM109,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及测序分析,为了解该毒株的遗传变异及基因结构与生物功能的关系,为开发牛病毒性腹泻病毒新型疫苗奠定基础。测序结果表明,该病毒全基因序列核苷酸为12 302nt(GenBank登录号:JN704144),该病毒基因组具有一个11 694nt开放阅读框编码的多聚蛋白,5′-UTR长382nt,3′-UTR长224nt,BVDV1-3156的全基因组序列分析发现该毒株为BVDV1b亚型。Blast比对分析显示,该毒株与VEDEVAC株的相似性最高,为90.9%。该毒株与BVDV1型其他毒株的全基因组序列具有较大的差异。     

猪萨佩罗病毒VP1蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

为建立猪萨佩罗病毒(PSV)的快速检测方法,本试验以重组VP1蛋白为包被抗原建立了检测PSV Ig G的间接ELISA方法。RT-PCR从PSV分离株SHCM2019中扩增VP1基因,将其克隆到原核表达载体p ET28a,对重组质粒pET28a-VP1进行原核表达,经Western-blotting检测后,利用VP1重组蛋白建立检测猪血清中PSV Ig G抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的VP1蛋白分子质量约为40 ku,与预期大小相符,Western-blotting表明,重组蛋白与PSV抗体阳性血清具有良好反应原性。以VP1蛋白为抗原建立的ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阳性血清均无交叉反应,特异性好;批内和批间的变异系数均小于10%,重复性好。利用建立的间接ELISA方法对95份猪临床血清样本进行检测,阳性率为44.21%。本研究建立的检测方法为PSV的血清学诊断提供了可靠手段。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

禽呼肠孤病毒99G株σB编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

采用RT-PCR方法扩增禽呼肠孤病毒(ARV)99G株σB编码基因,序列分析表明,99G株σB编码基因与其他禽呼肠孤病毒的同源性为90%～99 9%,而与我国番鸭呼肠孤病毒S12株的同源性仅有60%;用BarnH Ⅰ和Xho Ⅰ酶将σB编码基因切下并克隆到表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-σB;鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,σB基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达的融合蛋白占总蛋白的41.46%,融合蛋白的分子质量为66 ku,主要以包涵体形式存在;Western-blot结果显示,该融合蛋白能与抗ARV阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性,可用于禽呼肠孤病毒病诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制.     

牛病毒性腹泻病毒P20及P14蛋白基因的表达及其产物的抗原性分析

将牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)p20和p14基因分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX-HTb,并转化至相应的宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α中表达。P20蛋白在2个宿主中都获得了高效表达;P14蛋白在BL21(DE3)pLysS中表达量较低,而在DH5α中未见表达。对P14蛋白诱导表达过程的监测表明,P14蛋白对大肠杆菌是一种毒性蛋白。用Western-blotting分析未能检测到两种蛋白的反应条带,推测这两种蛋白可能存在构象表位。     

牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及原核表达

为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的免疫学特性,根据MAG1基因序列,设计并合成了1对用于扩增MAG1基因的引物。将PCR扩增产物连接到原核表达载体pGEX-4T-2上,转化大肠杆菌BL21(DE3)中。SDS-PAGE结果显示,MAG1在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,表达蛋白的分子质量为65ku。Western-blot结果显示,表达的MAG1蛋白可被牛源犬新孢子虫阳性血清特异性识别,表明该MAG1蛋白具有较好的反应原性。本研究为新孢子虫病疫苗及诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

鹅细小病毒vp1基因的原核表达及抗原性分析

将鹅细小病毒(GPV)H1株vp1基因从pMD18T-vp1亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1的多克隆位点,构建了原核表达载体pGEX-6P-vp1,将其转化感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,结果获得了108ku的融合蛋白,该融合蛋白经亲和层析纯化并经Western-blot检测。结果表明,纯化的融合蛋白可与GPV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株M蛋白基因的克隆及原核表达

构建了TGEV TH-98株M基因序列的原核表达载体,利用RT-PCR方法从TGEVTH-98株中扩增出M蛋白基因,并亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1上,转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白。结果表明,从TGE TH-98株克隆到了M基因cDNA,该基因全长789 bp,与T014株、Purdue株、TFI株和96-1933株的M基因同源性分别为92.37%、98.35%、99.87%和96.96%。SDS-PAGE电泳结果显示,重组表达质粒获得了约57 ku的目的带,其中M蛋白的分子质量约为31 ku,与预期的结果一致;Western-blotting分析表明,融合表达产物可与TGEV全病毒制备的阳性血清发生反应。证实,TGEV的M基因高度保守,构建的M基因原核表达载体pGEX-6P-TM能在大肠埃希氏菌中获得高效表达。     

鸭肠炎病毒gB胞浆区基因片段的克隆及原核表达

为了研究鸭肠炎病毒gB胞浆区的反应原性,以鸭肠炎病毒C-KCE株为模板,扩增了gB胞浆区基因片段,并构建了其原核表达载体pET-32a-gB-N,将其转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,用SDS-PAGE及Western-blot检测目的蛋白的表达情况及其反应原性。SDS-PAGE分析表明获得了30ku的融合蛋白,在Western-blot检测中,纯化的融合蛋白可与鸭肠炎病毒阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。     

H9N2亚型禽流感病毒M1基因的克隆及其原核表达

为克隆H9N2亚型禽流感病毒M1基因并研究其原核表达产物的反应原性,从H9N2亚型禽流感病毒中提取病毒基因组RNA,采用RT-PCR方法克隆了M1全长基因。把M1基因克隆至pMD18-T载体中之后进行测序。M1基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体中,构建重组表达质粒pET-28a-M1。该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导表达,对表达产物进行纯化和鉴定。测序分析结果表明,本研究克隆的M1基因与数株甲型流感病毒的M1基因的核苷酸同源性为89.7%~99.1%。SDS-PAGE分析表明,构建的重组蛋白以可溶性形式存在。Western-blot鉴定结果表明,它具有良好的反应原性。M1的成功表达为进一步研制新型流感疫苗奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒Erns基因的真核表达及抗原性检测

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns基因的生物学功能,将含有牛病毒性腹泻病毒 Erns基因的质粒pMD18-T-Erns经BamH I／HindⅢ双酶切,获得了Erns片段,再与杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A连接,构建成重组质粒。将重组质粒pBlueBacHis2A-Erns与Bac-N-BlueTM DNA 共转染至sf9昆虫细胞中,获得了重组病毒,经噬斑筛选纯化,感染sf9昆虫细胞进行表达。SDS- PAGE分析结果表明,表达的目的蛋白大小约30 ku;Western-blotting检测表明,该蛋白具有良好的抗原性。     

牛病毒性腹泻病毒玛纳斯株E2基因的克隆及其主要抗原表位区的分段表达

应用RT-PCR方法扩增了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)新疆玛纳斯分离株的E2基因,应用软件对序列进行分析,预测了可能存在的抗原表位;分别扩增了包含预测抗原位点的片段(1～118)-(144～340)-(100～300)-(1～345),并将其克隆到pMD18-T Simple载体中;将重组质粒pMD-(1～118)、pMD-(144～340)、pMD-(100～300)、pMD-(1～345)的HindⅢ+Bam H Ⅰ双酶切产物分别插入pET28a(+),构建了原核表达载体pET-(1～118)、pET-(144～340)、pET-(100～300)、pET-(1～345).将这些原核表达载体分别导入BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE分析,结果显示,4个重组质粒在BL21(DE3)中均成功表达,表达融合蛋白的分子质量分别为18.6、28.2、29.2和43.9 ku,与预测蛋白质分子质量一致,Western-blot分析结果表明,28.2、29.2和43.9 ku的融合蛋白可被牛抗BVDV阳性血清识别.     

山羊源副流感病毒3型JS2013株HN基因的原核表达与抗原性分析

参考GenBank中牛副流感病毒3型(BPIV3)内蒙古09株(NM09)全基因组序列(GenBank登录号:JQ063064),设计了1对特异性引物以扩增山羊源副流感病毒3型(PIV3)JS2013株HN基因部分序列;将扩增到的基因测序后进行同源性分析。同源性分析结果表明,它与已报道的HPIV3、BPIV3 HN基因的序列同源性最高,分别为74.3%、79.8%。进化树分析表明,JS2013株并不属于HPIV3与BPIV3,形成一个独立的分支。将HN基因片段克隆至原核表达载体pET-32a(+),获得原核重组质粒pET-32a(+)-HN。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态菌株中,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE与Western-blot试验分析表明,重组蛋白诱导表达成功,并以包涵体形式存在,大小为46ku。经Western-blot试验验证,重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备的超免疫血清能够与重组蛋白反应;把病毒接种给MDBK细胞后,间接免疫荧光试验表明重组蛋白的多克隆抗体与病毒产生特异性荧光反应,表明该重组蛋白具有很好的免疫原性和反应原性。本试验结果为山羊源副流感病毒3型感染诊断方法的建立和疫苗的研制奠定了基础。     

无血凝性兔出血症病毒VP60蛋白分子特性的分析及其在大肠杆菌内的高效表达

分离出1株在4、25、37℃条件下均不能凝集人"O"型红细胞的兔出血症病毒(RHDV),命名为SQ-1株;采用RT-PCR扩增获得病毒主要结构蛋白VP60蛋白基因,并对目的基因进行测序及分析;将目的基因定向克隆入原核表达载体pET-30a的多克隆位点,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达,纯化重组蛋白,用Western-blot检测其反应原性。测序与同源性分析结果显示,该毒株属于RHDV抗原遗传变异株(RHDVa),所扩增的VP60基因的ORF为1 740bp,编码579个氨基酸残基,与世界上其他RHDV毒株的核苷酸序列的同源性为89.9%～98.0%,与已报道的无血凝特性的病毒株whn-1株及低血凝性的Rainham株的核苷酸序列的同源性分别为95.2%及90.8%。重组质粒经IPTG诱导后目的基因获得表达,重组蛋白与预期大小一致,分子质量约为60ku,主要以包涵体形式存在。Western-blot检测证实,纯化蛋白能够与RHDV阳性血清发生良好的杂交反应,说明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

通用型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是牛的主要病原之一,对全球养牛业造成了巨大的经济损失。本文根据GenBank中BVDV基因组中5′-UTR序列合成引物,建立了同时检测BVDV两个基因型的RT-PCR方法。结果显示,所建方法具有较强特异性和敏感性,可扩增出长约300 bp的特异性片段,最低检测限量为6.8×10~3copies/μL。用该方法对30份临床样品进行病原检测,结果显示,BVDV阳性样品4份,阳性率为13.33%。对阳性PCR产物测序及序列分析的结果表明,该牛病毒性腹泻病毒流行株属于BVDV-2型。3份阳性样品SD3、NM26、NM29与国内流行株新疆XJ-04亲源关系最近,相似度达96.9%。本研究建立的通用型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,可用于临床上牛病毒性腹泻病毒的检测。     

青海牦牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

采集青海省泽库县某牧户疑似牦牛病毒性腹泻病牛的样品,将RT-PCR检测为阳性的样品处理后接种MDBK细胞,并盲传至第10代,检测每一代细胞中牛病毒性腹泻病毒的E0基因。通过分离株接种细胞后产生的病变效应观察、免疫荧光试验、电镜观察、RT-PCR扩增以及序列分析鉴定了该病毒。结果表明,盲传的每代细胞中均可检测到E0基因;接毒后的细胞在盲传至第7代时出现明显的细胞病变;免疫荧光试验中能观察到细胞内发出的特异性荧光;经浓缩、纯化的病毒在电镜下呈直径为40～60nm的病毒粒子,将其命名为QHZK株。对克隆的E0基因测序后提交至GenBank(登录号:JF927789),并将获得的序列与其他国内外分离株的E0序列比对,同源性为73.6%～98.2%;系统进化分析表明该分离株属于牛病毒性腹泻病毒1b亚型。     

猪源牛病毒性腹泻病毒1型分离株的鉴定及培养特性研究

利用RT-PCR方法从猪场腹泻样品中检测到牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核酸阳性样品,测序证实为1型BVDV,命名为SHCM06。遗传进化分析表明,其与ZM-95亲缘性最近,同源性达98.3%;与BVDV-1经典毒株亲缘性较远,仅85.7%~89.8%。免疫荧光、Western-blot和荧光定量RT-PCR检测均表明,SHCM06毒株可感染MDBK、ST和PK15细胞,在MDBK和ST细胞上的增殖效率显著高于PK15细胞。进一步分析SHCM06感染对细胞中Ⅰ型干扰素表达的影响,结果显示,SHCM06感染均能使3种细胞中IFN-α和IFN-β表达量显著下降(P0.05),且对MDBK细胞IFN-α的抑制效果显著高于对PK15细胞中IFN-α的抑制作用(P0.05)。结果表明,从猪临床腹泻样品中分离1株BVDV1型,该病毒对MDBK、ST细胞适应性好于PK-15细胞,能显著抑制细胞中Ⅰ型IFN的产生,以发挥抵抗细胞抗病毒免疫效应,本试验为深入研究猪源BVDV的致病作用奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒荧光标记单克隆抗体的制备及鉴定

为制备可以区分牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因型的荧光标记单克隆抗体,分别利用分泌抗牛病毒性腹泻Ⅰ型病毒(BVDV-Ⅰ)、牛病毒性腹泻Ⅱ型病毒(BVDV-Ⅱ)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV-Ⅰ和BVDV-Ⅱ)单克隆抗体的杂交瘤细胞株BV1、BV2、BV12,腹腔接种BALB/c小鼠,大量制备单克隆抗体,用辛酸-硫酸铵法提纯,经活性、浓度、纯度检测合格后,利用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联,制备成3种荧光标记单抗。结果显示,3种标记单抗的F/P比值范围均在2.0～4.0之间;细胞DFA法测定其效价均≥1∶200;抗原交叉试验证实标记单抗的特异性良好;标记单抗可以检测到1TCID50的病毒粒子;临床初步应用表明,3种标记单抗的阳性检出率均≥95%,与进口BVDV荧光抗体的符合率为100%。3种荧光抗体的研制对BVDV基因分型鉴定、NCP型BVDV的鉴定以及BVDV与CSFV的鉴别诊断有很好的应用价值,值得进一步开发。     

小反刍兽疫病毒H基因胞外区的表达与分析

为了掌握小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白胞外区的功能,根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的H基因序列设计相应引物,分别克隆tH基因后构建原核表达载体pET-30a(+)-tH和真核表达载体pPIC9K-tH。将测序正确的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和酵母菌GS115,而后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,tH蛋白均获得了高效表达,融合蛋白的分子质量约为60ku,原核表达产物以包涵体的形式存在,其表达产量为4.68g/L,而目的蛋白的真核表达产量为0.5~1g/L。Western-blot分析表明,所表达的重组蛋白能被抗PPRV Nigeria 75/1株的阳性家兔血清特异性识别。结果表明,成功表达了小反刍兽疫病毒H基因胞外区,重组表达蛋白具有良好的反应原性,这为PPRV H蛋白与其受体相互作用功能区的确定奠定了基础。