鸡胚接种新城疫疫苗免疫效果的观察

鸡胚免疫接种简称鸡胚免疫 ,是一种新型的免疫技术。鸡胚免疫 ,最早是美国地方家禽研究室Ｓｈａｒｍａ等于 2 0世纪 80年代初开始进行尝试。 2 0多年来 ,国内外学者进行了大量研究 ,并取得了可喜的成就。本试验旨在探索新城疫 (ＮＤ)疫苗不同接种剂量对 18日龄鸡胚的免疫效果。1　材料与方法1.1　种蛋来源　购自湖南衡阳偏远农村未进行过任何免疫接种的土杂鸡蛋。1.2　疫苗　湖南省生物制药厂提供的ＮＤＶⅡ系弱毒苗 ,批号为 92 5 6 4;中国兽药监察所提供的Ｆ4 8Ｅ8株冻干ＮＤＶ强毒 ,由湖南农业大学动物科学院病理教研室继代保存。1.3　孵…     

新城疫病毒HN蛋白及其基因的分子生物学

新城疫（ＮｅｗｃａｓｔｌｅＤｉｓｅａｓｅ,ＮＤ）是一种在鸡群中具有高度传染性的病毒性传染病,能感染雉、鸽和野生鹦鹉等多种鸟类。目前全世界已分离出致病性不同的ＮＤＶ毒株达数十种之多,不同的毒株致病性差异很大,可分为速发型（Ｖｅｌｏｇｅｎｉｃｓｔｒａｉｎ...     

绿孔雀新城疫的快速诊断与紧急防制

绿孔雀新城疫的快速诊断与紧急防制吴长新梁惠良１）彭大新焦库华（扬州大学农业部畜禽传染病重点实验室２２５００９）世界各国对新城疫（ＮＤ）的研究已有６０多年的历史，广泛应用各种ＮＤ疫苗进行免疫防制也有３０多年。新城疫病毒（ＮＤＶ）对鸡、火鸡、珍珠鸡及雉鸡...     

鸡IB弱毒疫苗对鸡ND弱毒疫苗免疫干扰的试验观察

鸡ＩＢ弱毒疫苗对鸡ＮＤ弱毒疫苗免疫干扰的试验观察郑厚旌邓纪英１）张健林陈桂霞（河南农业大学牧医工程学院郑州４５０００２）据报道，应用鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）与新城疫病毒（ＮＤＶ）分别先后接种ＳＰＦ鸡胚，两种病毒之间存在干扰现象，被干扰的ＮＤＶ毒...     

鸡胚接种新城疫疫苗的免疫效果

鸡胚接种新城疫疫苗的免疫效果１）许美解黎满香艾国良陈可毅唐连飞（湖南农业大学动物科技学院长沙４１０１２８鸡新城疫（ＮＤ）的预防免疫接种，目前以测定ＨＩ抗体效价为依据来确定首免日龄和制定免疫程序。许多鸡场，按此程序使用ＮＤ疫苗后爆发ＮＤ仍时有发生。免疫...     

DNA-RNA杂交法鉴别新城疫强毒株和弱毒株

ＤＮＡＲＮＡ杂交法鉴别新城疫强毒株和弱毒株１）贺东生刘福安宋长绪（华南农业大学动物医学系广州５１０６４２）新城疫（ＮＤ）是由新城疫病毒（ＮＤＶ）引起鸡的急性高度致死性传染病。ＮＤ的快速诊断是控制该病的重要环节，但由于弱毒疫苗株的广泛应用，对该病的诊...     

鸡非典型新城疫并发传染性腔上囊病的诊断及防制

鸡新城疫 (ＮＤ)是由副黏病毒引起的鸡的一种高度接触性传染病 ,发病率和病死率均较高 ,对养鸡业危害较大。通常人们将引起急性死亡、发病率高、致死率高、具有典型消化道病变及神经症状的ＮＤ称为典型ＮＤ ,将发病率低、致死率低、症状不典型的ＮＤ称为非典型ＮＤ ,后者主要发生于免疫鸡群。非典型ＮＤ发病率一般在 10 %～ 30 % ,致死率一般在 15 %～ 4 5 %。现在 ,由于集约化养殖场、养殖专业户饲养管理、防疫水平提高 ,典型ＮＤ的暴发流行已很少见 ,而非典型ＮＤ的发生则较普遍 ,且常与传染性腔上囊病 (ＩＢＤ)前后或同时发生。ＩＢＤ是…     

用口蹄疫非结构蛋白鉴别康复动物与注射疫苗动物的研究及应用

1996年 ,Ｂｒｏｗｎ等从口蹄疫病毒 (ＦＭＤＶ)感染的组织液中发现了病毒感染相关 (ｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ,ＶＩＡ )抗原 ,即ＦＭＤＶ非结构蛋白 3Ｄ ,并建立了琼脂免疫扩散 (ＡＧＩＤ)试验 ,用于进出境动物检疫 ,以区分ＦＭＤＶ感染动物和注射疫苗动物。之后Ｐｉｎｔｏ等在用ＡＧＩＤ试验进一步研究注射灭活疫苗动物的ＶＩＡ抗体时发现 ,注射疫苗前和接种一次疫苗的动物血清ＶＩＡ抗体均为阴性 ,而重复接种福尔马林灭活疫苗或ＡＥＩ灭活疫苗的动物 ,其血清中都不同程度的含有ＶＩＡ抗体。这一结果对用ＡＧＩ…     

抗新城疫病毒因子抗病毒作用的研究

用新城疫病毒（ＮＤＶ）乳化疫苗免疫鸡，从高免卵黄中提取抗新城疫病毒因子，观察其对未免疫和免疫过的新城疫流行鸡群的治疗效果。结果对未免疫的新城疫流行鸡群的保护率为４４％（Ｐ＜０．０５）；对免疫过的新城疫流行鸡群的保护率为８９％（Ｐ＜０．００１）；临床治疗也显示出较好的效果。该因子在冰箱中贮存４ａ不失效。该制剂可能为防治鸡新城疫提供一种新的方法     

用鸡胚监测火鸡疱疹病毒疫苗的效力试验

目前防制鸡马立克氏病 (ＭＤ)的措施主要是接种疫苗 ,但免疫失败时有发生 ,造成免疫失败的诸多因素中 ,最主要的就是疫苗蚀斑形成单位 (ＰＦＵ)的损失。为检测疫苗的效力和提高鸡群的免疫效果 ,笔者把火鸡疱疹病毒 (ＨＶＴ)疫苗接种于鸡胚卵黄囊 ,检查绒毛尿囊膜 (ＣＡＭ)上病毒痘斑生长情况 ,以此作为ＨＶＴ疫苗免疫前效力监测的手段 ,获得了满意效果。1　材料与方法1.1　疫苗　用国产和进口ＨＶＴ疫苗 3 0批次 ,分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个组进行试验。1.2　鸡胚　经隔离饲养、血清学检验 (ＡＧＰ)无ＭＤ抗体的种鸡所产蛋孵育的 4～ 5日龄健康鸡胚…     

新城疫病毒F48E9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因1700 bp克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建成表达F基因的载体pc3F.然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的3800 bp DNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒(HVT)非必须片段载体pTK2B中,构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒载体pTK3F.经限制性内切酶酶切分析,F基因表达盒的插入方向与pTK2B中TK基因转录方向一致.该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的HVT重组病毒奠定了基础.     

新城疫病毒F48E9株M NP F和HN基因的真核表达

将新城疫病毒(NDV)F48E9株的M、NP、F和HN基因克隆到真核细胞表达载体 pCAGG上,经酶切、PCR鉴定和序列分析,分别筛选出了含有M、NP、F和HN基因的重组质粒, 命名为pCAGG-M、pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN。纯化后的重组质粒通过脂质体单独转染HeLa细胞,经间接免疫荧光试验检测到了M、NP、F和HN蛋白的表达。pCAGG-M、 pCAGG-NP、pCAGG-F和pCAGG-HN重组质粒组合共转染HeLa细胞48 h后,可以观察到明显的细胞融合现象。试验结果表明,NDV F48E9株的M、NP、F和HN蛋白均在HeLa细胞内得到了成功表达,同时证明在该表达系统中F蛋白不足以诱导细胞融合。     

鹅源新城疫病毒单克隆抗体的研制及其与不同NDV毒株的反应性

以鹅源新城疫病毒(NDV)作为免疫原免疫BALB/c小鼠,获得了5 株具有HI特性的单克隆抗体,分别命名为2G5、3A4、3B5、6B1 和8C5,其腹水HI 效价分别为214、212、29、215 和28。竞争ELISA结果表明,2G5、3A4、3B5和6B1在HN蛋白上所针对的表位属于同一抗原区,而8C5针对的表位为另一抗原区。将上述5株单抗与不同来源的NDV进行了HI排谱试验。结果显示,同一抗原区4株单抗的反应谱比较一致,而与另一抗原区单抗8C5 的反应谱明显不同。5 株单抗与鹅源NDV毒株的反应性较强,而与鸽源NDV毒株的反应性较弱。这5 株单抗用HRP标记后再与不同单抗进行交叉夹心ELISA,得到了一个新的系统(2G5 8C5)。用该系统对NDV分离株做排谱试验。结果显示,该系统与鹅源NDV分离株的反应性较好,表明所建立的新系统可用于鹅源NDV的检测。     

我国新城疫强毒株F糖蛋白基因的体外合成及其抗原性研究

将我国新城疫强毒株Ｆ４８Ｅ９在ＳＰＦ鸡胚增殖后提取ＲＮＡ，用自行设计的一对寡聚核苷酸引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，合成了Ｆ糖蛋白基因片段。将此片段与ｐＵＣ１９质粒重组，转化大肠杆菌ＪＭ１０９，从阳性克隆中提取重组质粒，再用ＰＣＲ法扩增，获得了同样大小的ＤＮＡ片段。经用特异性抗体探针检测，证明该片段在大肠杆菌中的表达产物具有良好的抗原性     

东北地区新城疫流行株的分子生物学特性调查

从东北地区发生新城疫 (ND)的病鸡、病鸽和产蛋下降鸡分离到 19株NDV ,对其融合蛋白 (F)基因 5 32bp或 2 80bp片段进行了克隆、测序 (在GenBank中的登录号为AY2 0 86 80～AY2 0 86 98) ,并对各株的F基因序列进行了比较。结果 ,各毒株之间的核苷酸同源性为 83.1%～10 0 % ,氨基酸同源性为 85 .5 %～ 10 0 % ;系统发育进化树分析表明 ,其中 2株与疫苗株V4同属基因Ⅰ型 ,为弱毒株 ;其余 17株为强毒株 ,其中 2株为基因Ⅵ型 ,其余为基因Ⅶ型。表明东北地区目前由 3种基因型的NDV毒株 (Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型 )所引发 ,并以基因Ⅶ型为主。另外 ,对其中的代表毒株APMV1/chicken/China/JL 11/ 0 2进行了免疫学试验 ,结果显示 ,LaSota疫苗的免疫保护效果不理想 ,可能是LaSota疫苗免疫鸡群发生ND的主要原因。     

黑龙江省和河北省鸡新城疫病毒分离株的遗传变异分析

利用 RT PCR 技术扩增出了 4 株 NDV 分离株(HeB 4 99, HeB 5 99、HeB 6 02 和HLJ 10 02)F基因539 bp的片段,将该片段克隆到 pMD 18 T载体上。经酶切分析、质粒 PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得了4株 NDV分离株 F基因部分片段的重组质粒。同源性分析显示,4株分离毒株的核苷酸序列具有 95.9%~100%的同源性,与 LaSota的核苷酸序列同源性为81.0%~81.8%,与F48E9的核苷酸序列同源性达85.8%~89.3%。推导氨基酸序列分析表明,4个毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112RRQKRF117,具有强毒株裂解位点氨基酸组成特点,与ICPI和MDT测定结果相吻合。73株NDV毒株的系统发育进化树分析表明,HeB 4 99、HeB 5 99、HeB 6 02和HLJ 10 02均归属于基因Ⅶ型。     

NDV感染的鸡胚成纤维细胞TLR7 mRNA表达的动态变化

为研究新城疫病毒(NDV)感染过程中,鸡Toll样受体7(chTLR7)表达的变化情况,采用Trizol法抽提NDV感染组和正常对照组鸡胚成纤维细胞(CEF)的总RNA,反转录成cDNA。以β-actin基因为内参,应用实时荧光定量PCR法检测细胞中chTLR7基因表达的动态变化。结果显示,CEF被NDV感染后第12、24、36、48小时,感染组chTLR7mRNA表达量分别是正常对照组的18.63、0.05、1.37、10.62倍,组间差异均极显著(P<0.01)。结果提示,chTLR7可能参与了NDV感染CEF的早期过程。     

用抗体致敏SPA菌体浓缩新城疫病毒方法的建立

将金黄色葡萄球菌与灭活的猪抗新城疫病毒(NDV)抗血清混合,37℃感作致敏30min,将致敏的金黄色葡萄球菌加入NDV污染材料洗脱液中,37℃水浴30min,离心洗涤并悬浮菌体于PBS中,取适量用于电镜观察或RTPCR。结果显示,电镜下观察可见NDV吸附到金黄色葡萄球菌表面;经RTPCR对吸附NDV的菌体进行扩增后可见到特异性扩增带。通过条件优化,建立了NDV浓缩方法。用HA效价为29的NDVF48E9毒株尿囊液1∶800、1∶1600和1∶3200稀释液分别喷洒树叶及谷物,采用上述方法浓缩病毒,并经RTPCR检测。结果表明,致敏的金黄色葡萄球菌能够浓缩病毒,提高RTPCR检测的敏感性。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒(NDV)基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示,强毒株可以扩增出442 bp的特异性片段和671 bp的通用片段,弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671 bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR,整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定,该方法最低能检测到100 pg的NDV RNA。     

新城疫病毒F蛋白免疫活性片段的原核表达

利用已构建的新城疫病毒F基因重组质粒,通过氨基酸序列分析和InsightⅡ基因工作站的MODELER程序和同源模建技术,预测了试验株F蛋白的表面抗原分布位置.设计引物扩增了2段含有多个抗原位点的多肽片段,通过双酶切定向克隆到原核表达载体pET32a,获得了重组质粒pET32a-F1和pET32a-F2以及2个片段串联起来后克隆的重组质粒pET32a-F3.重组质粒经诱导表达并取产物进行分析,结果显示,F1、F2、F3片段均获得了融合表达.Western-blotting证实,表达产物F1、F2和F3与NDV阳性血清均具有免疫反应性.用表达的重组蛋白加免疫佐剂经皮下接种免疫鸡,免疫2次后产生较高的抗体水平,用100 LD50的超强毒株GD-05-2攻击,重组蛋白免疫组鸡可达到约70%的保护率,并可显著抑制排毒.