成年发情期奶山羊下丘脑催产素及其mRNA的表达

应用免疫组织化学SP法和原位杂交法研究了催产素(oxytocin,OT)及OT mRNA在成年发情期奶山羊下丘脑中的分布和表达。结果,OT免疫反应阳性细胞主要分布在视上核和室旁核,在视上弥散核、弓状核、室周核和乳头体各核团也存在免疫阳性神经元;在室旁核、视上弥散核、正中隆起和第三脑室附近有较多数量的强阳性神经纤维,在交叉上核有少量阳性神经纤维。在下丘脑23个核团(区)中均能检测出OT mRNA的阳性细胞。结果表明,OT和OT mRNA在下丘脑中分布广泛,且OT可能通过轴突传递和血液运输,将OT mRNA合成的OT运送到别的核团;OT在奶山羊发情过程中发挥了重要作用。     

催产素、加压素神经元在奶山羊下丘脑的分布

本文以硫代硫酸醛复红法(TAF)来显示催产素、加压素神经元的形态特征及其在奶山羊下丘脑中的分布。结果表明:这两种神经元均为多极神经元。胞体较大,呈圆形、梭形、梨形等形态,胞质中有丰富的分泌颗粒,它们集中分布在视上核(SON)和室旁核(PVN)中,有少量的神经元可分布在室周核、环状核、穹窿周核和交叉上核。个别的可出现在视前区、下丘脑前区、下丘脑外侧区、前联合核等部位。在一些主要分布的核团内还可见到大量的神经纤维和毛细血管,有的神经纤维内可明显地见到串珠状的分泌颗粒。神经元的突起及神经纤维有较明显地走向第三脑室和附近血管的趋势。因此,催产素和加压素有向脑室和血管释放的可能性。在细胞外还可见到较多的阳性颗粒,成堆分布,这些可能是催产素和加压素中的结合蛋白分离后被着色的结果,有待于进一步研究。     

干扰素-γ对妊娠早期大鼠下丘脑中胰岛素样生长因子-Ⅰ表达及妊娠结局的影响

将妊娠9 d的大鼠随机分为对照组、试验1组、试验2组,采用生殖道肌肉注射的方法分别注射生理盐水、2.5×104U干扰素-γ(IFN-γ)、7.5×104U IFN-γ,采用免疫组织化学SP法研究IFN-γ对妊娠早期大鼠下丘脑中胰岛素样生长因子-Ⅰ的表达和妊娠结局的影响。结果显示,IGF-Ⅰ在下丘脑视前室周核、视上核、视前大细胞核、视前内侧核、视前外侧核均具有较多数量的阳性神经元表达;阳性细胞呈圆形、卵圆形、三角形,阳性物质大多位于细胞质和细胞核;生殖道肌肉注射IFN-γ后能下调IGF-Ⅰ在下丘脑的表达。同时,观察到试验2组妊娠大鼠子宫黏膜表面有大量紫褐色吸收斑。提示IFN-γ对妊娠早期大鼠IGF-Ⅰ在下丘脑的表达具有调节作用,且外源注射7.5×104U的IFN-γ后,会造成妊娠早期大鼠流产。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒生殖生物学的研究进展

从内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)的基因结构特点、染色体中的分布、在绵羊肺腺瘤发生过程中的作用、孕体植入前的作用、对胎盘形成的影响等方面综述了enJSRV生殖生物学作用的最新研究进展,为哺乳动物内源性逆转录病毒生殖生物学领域的研究提供了新的思路.     

高原地区成年藏绵羊和小尾寒羊附睾组织中eNOS的差异表达研究

采用免疫组化SP法结合IPP统计分析法,比较高原地区成年藏绵羊和小尾寒羊附睾组织中eNOS的定位及分布特征。结果显示,eNOS在藏绵羊及小尾寒羊附睾各部分间质及血管壁均有表达,藏绵羊管腔上皮未见表达,而在小尾寒羊主要定位于附睾各部分管腔上皮。平均光密度值统计表明,eNOS在藏绵羊附睾尾部显著高于附睾头和附睾体(P0.05),小尾寒羊附睾体eNOS的表达显著高于藏绵羊(P0.05)。本研究提示在高原低氧环境中eNOS参与血管舒缩调节附睾局部微循环对氧的摄取;eNOS在小尾寒羊附睾管腔上皮的强表达可能是附睾微环境低氧应激反应的一个方面,它在高原地区动物附睾的调节机制有待于进一步研究。     

羔羊丘脑下部催产素的免疫组化定位

采用免疫组织化学技术中的链霉素抗生物素 过氧化酶(streptaridin peroxidase,SP)法,对羔羊丘脑下部催产素(oxytocin,OT)神经元的定位及分布进行了研究。结果表明,丘脑下部分泌OT的神经元主要分布在室旁核和视上核,在环核、视上弥散核、弓状核、室周核、穹窿周核、丘脑下部前区、丘脑下部外侧区、丘脑下部后核和乳头体各核团等也有一定数量的阳性神经元;阳性神经纤维仅见于室旁核、视上弥散核、视上核和交叉上核,在正中隆起第三脑室附近有较多数量的阳性神经纤维。观察结果提示,OT在羔羊丘脑下部分布广泛,且丘脑下部OT经神经垂体、第三脑室、血管3条途径释放,经血液循环最终作用于靶细胞而发挥生理作用。     

神经肽Y免疫阳性神经元在江汉鸡延髓内的分布

为了探明江汉鸡延髓内神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)免疫反应神经元的分布状况,采用石蜡切片和免疫组织化学链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合法(SABC法),对10羽江汉鸡的延髓进行了研究,并与北京鸭、乌鸡、肉鸡及大鼠的相关研究结果进行了比较。在光镜下观察分析了阳性神经元的分布状况,并用图像分析系统进行半定量分析。免疫组织化学染色结果显示,NPY阳性神经元主要存在于延髓下橄榄核中,孤束核及中缝核也有少量表达。表明,江汉鸡延髓NPY阳性神经元的分布与肉鸡、乌鸡、大鼠的大体相似;下橄榄核可能是NPY在延髓-小脑传递通路中的一个重要枢纽。     

胰岛素样生长因子及其受体mRNAs在绵羊生殖系统中的表达和分布

为检测胰岛素样生长因子(IGFs)及其受体(IGFR)mRNAs在绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管中的表达,探讨绵羊胚胎早期发育过程中其发育环境——生殖道中生长因子的表达、分泌及其作用,取绵羊发情周期早期卵巢、子宫和输卵管,经固定、切片、免疫染色,观察IGFs mRNAs的表达和分布情况。同时用RT-PCR技术研究了各组织中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-ⅡR mRNAs的表达情况。结果表明,IGFs mRNAs在绵羊发情周期早期的卵巢、子宫和输卵管中都有表达,4种因子表达模式相似:在卵巢中,IGFs主要定位于卵泡颗粒细胞,间质细胞亦有少量表达。在输卵管中,上皮细胞免疫染色呈阳性;在子宫中,腺细胞及上皮细胞的阳性信号强于固有层。RT-PCR检测表明IGFs mRNAs在3种组织中均有表达。     

犬MG53基因的克隆与表达

为进一步研究犬MG53在机体内的分布情况及其生物活性,本研究设计特异性引物进行犬MG53目的基因的克隆,并将其连接至p MAL-C5X表达载体中,利用大肠杆菌表达系统进行表达。结果显示,克隆得到由1 435个核苷酸构成的犬MG53基因;获得MG53蛋白与麦芽糖结合蛋白标签(MBP)融合表达的可溶性重组蛋白,大小约为95 ku。通过结构及生物学功能预测发现,该蛋白易降解,具有RING、B-Box、Coiledcoil及SPRY-PRY四个功能结构域,并分布有半胱胺(Cysteamine)、2-氨基乙硫醇(2-Amino-1-Ethanethiol)、硫代乙醇胺(Thioethanolamine)、2,3-Deshydrolanthionine、Zn2+及Mg2+等分子结合位点,具有蛋白结合能力。上述结果表明,犬MG53与人、家兔、小鼠、大鼠MG53的结构相似,并可能具有参与泛素化、骨骼肌细胞修复等重要的生物学功能。     

VEGF在绵羊性成熟前后睾丸组织中表达水平的比较分析

为探索血管内皮生长因子(VEGF)在绵羊睾丸发育和精子发生过程中的作用,本研究以绵羊性成熟前后睾丸组织为研究对象,采用RT-PCR和Western-blot方法检测VEGF m RNA及其蛋白在绵羊性成熟前后睾丸组织中的表达差异,利用SSPS 18.0对数据进行比较分析。结果显示,VEGF m RNA及其蛋白在绵羊性成熟前后睾丸组织中均有表达,二者在性成熟后睾丸中的表达量明显高于性成熟前睾丸(P0.05),且VEGF m RNA与蛋白的表达趋势趋于一致。由此可见,VEGF在绵羊睾丸发育和精子发生过程中具有促进作用,这为进一步探索VEGF在睾丸中的作用机制奠定了一定的理论基础。     

间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊早期胚胎中的表达

为了研究间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊胚胎早期发育过程各阶段的表达情况,利用RT-PCR扩增得到绵羊Cx43(43 ku)及Cx45(45 ku)基因的mRNA,并进行序列测定。收集绵羊未成熟和成熟卵母细胞以及体外受精早期胚胎各发育阶段的卵裂球细胞,通过RT-PCR半定量检测Cx43和Cx45基因的mRNA表达量;通过免疫组织化学方法结合激光扫描共聚焦显微镜检测Cx43和Cx45蛋白在绵羊体外受精的早期胚胎发育过程中的表达情况及表达区域。结果表明,在绵羊卵母细胞成熟过程以及早期胚胎发育的各个时期,Cx43及Cx45在mRNA水平和蛋白水平均有表达;Cx43、Cx45蛋白主要分布在细胞膜表面,在细胞质和细胞核中表达微弱。研究结果为进一步探索Cx43和Cx45在绵羊早期胚胎发育过程中的作用提供了试验数据。     

绵羊BST-2B基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了表达含有绵羊BST-2B(o BST-2B)基因的重组蛋白,用RT-PCR方法扩增绵羊肺细胞的o BST-2B基因,并将其克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组表达质粒p GEX-4T-o BST-2B。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组o BST-2B蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备抗o BST-2B的多克隆抗体。蛋白免疫印迹分析和间接免疫荧光试验检测结果显示,该抗体具有较好的反应原性。本试验成功制备的o BST-2B蛋白及多克隆抗体,为研究o BST-2B蛋白的生物学功能及羊传染病的致病机制提供了良好的基础材料。     

雌激素受体在间情期绵羊输卵管上皮细胞中的表达

为探讨膜性雌激素受体GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1)及雌激素核受体ERα、ERβ在绵羊输卵管上皮细胞中的表达和定位,探讨三种受体在间情期绵羊输卵管中的表达规律,通过RT-qPCR方法和免疫印迹方法分别检测了三种受体基因mRNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫组化法对输卵管组织中三种受体基因进行定位并对结果进行光密度值分析。结果,输卵管上皮细胞中GPER相对表达量高于ERα、ERβ(P0.01),ERα的相对表达量高于ERβ(P0.05)。免疫组化结果显示,GPER广泛分布于绵羊输卵管上皮细胞中,主要定位于细胞膜及细胞质。而ERα及ERβ主要分布于绵羊输卵管上皮细胞的细胞核。阳性细胞光密度分析结果与荧光定量RT-qPCR的分析结果相一致。上述结果表明,间情期绵羊输卵管上皮细胞中同时存在GPER、ERα、ERβ三种雌激素受体表达,且GPER的平均光密度、mRNA相对表达量最高,ERβ的平均光密度、mRNA相对表达量最低。     

靶向enJSRV env基因shRNA真核表达质粒的构建及其干扰效率的测定

为探讨绵羊内源性反转录病毒(enJSRV)在绵羊胚胎发育过程中的作用,利用脂质体将pEGFP-C1空载体转入绵羊绒毛膜滋养层细胞中,测定其转染效率。同时构建抑制enJSRV env基因的RNA干扰质粒,并将其转染到能稳定表达enJSRV env基因的绵羊绒毛膜滋养层细胞中,通过荧光定量PCR检测其干扰效率。结果显示,重组干扰质粒enJRSV-env-shRNA-1、enJRSV-env-shRNA-2、enJRSV-env-shRNA-3、enJRSV-env-shRNA-4、Negative-shRNA构建成功。Lipofectamine LTX脂质体体积为6.0μL,转染混合物体积为100μL,转染48h组的转染效率最高,为42.37%。与正常对照组细胞的enJSRV-env mRNA表达量相比,转染靶基因干扰质粒的各组绵羊绒毛膜滋养层细胞中enJSRV-env mRNA表达量分别下调了73.56%、66.82%、33.66%和18.16%。筛选出了一个干扰效率最高的RNA干扰质粒enJRSV-env-shR-NA-1,为以后包装慢病毒及进行动物试验来揭示enJSRV的生殖生物学作用奠定了坚实的基础。     

泛素-蛋白酶体通路在神经系统中的生物学功能

概述了泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome system,UPS)的组成及其作用机理,着重阐述了其在神经系统中的生物学功能,主要包括UPS在神经元发育、突触的功能、突触的可塑性以及神经性疾病等方面的研究现状,为进一步揭示神经元的生长发育机理以及神经性疾病的研究提供参考。     

妊娠绵羊子宫内膜组织内源性反转录病毒及其受体HYAL2基因表达水平的检测

为了探究内源性反转录病毒(enJSRV)及其受体HYAL2在妊娠蒙古绵羊子宫内膜形成和发育过程中的作用,运用TaqMan实时荧光定量PCR和组织原位杂交技术对其在不同妊娠时期(30、50、70、90、110和130d)蒙古绵羊子宫内膜中的表达规律和分布定位进行了研究。实时荧光定量PCR结果显示,enJS-RV及其受体HYAL2在蒙古绵羊子宫内膜的不同妊娠时期均有表达,通过SPSS统计学软件分析可以看出,妊娠蒙古绵羊子宫内膜组织中enJSRV mRNA的表达于妊娠第30和50天相对较高,70～130d均低于对照组(30d),且差异都极显著,enJSRV与其受体HYAL2mRNA之间亦无线性相关性。原位杂交结果显示,enJSRV及其受体HYAL2mRNA在妊娠第30、50和130天蒙古绵羊子宫内膜的腔上皮细胞、腺上皮细胞、血管内皮细胞、间质及滋养层巨型双核细胞中均有阳性信号表达。表明enJSRV及其受体HYAL2表达于上皮细胞及上皮细胞来源的滋养层巨型双核细胞中,揭示enJSRV及其受体HYAL2在子宫形成过程中和系统防御中可能发挥重要作用。     

T淋巴细胞的分化抗原及其功能

骨髓干细胞进入胸腺后,在胸腺素介导下发育分化成具有细胞免疫活性的T淋巴细胞。这些分化的T淋巴细胞发生的变化表现在:细胞表面结构(主要是分化抗原)的不同,及在生物学效应上的差异。 目前,应用单克隆抗体(McAb)技术对淋巴细胞分化抗原进行了较详细的研究。但是,由于各实验室所用的McAb千差万别,因此对分化抗原的命名相当混乱,具有同一功能的抗原往往有多个名称。如对人和小鼠T淋巴细胞表面分化抗原的命名体系就有Thy、Ly、Lyt、OkT、Leu和Tac等多种。其他动物的分化抗原的名称又有差别,如绵羊用ST系统,牛用BOT系统。因此对分化抗原命名上的混乱现象,有必要予以澄清,这就是本文的一个目的。     

胰岛素受体mRNA在新生犊牛组织中的表达

应用半定量RT-PCR方法检测了新生犊牛中枢神经系统和外周组织中胰岛素受体(in-sulin receptor,InsR)基因的表达。结果表明,InsR基因在肝、皮下脂肪、半腱肌、胰、肾皮质、脾、心、肺、下丘脑、肠系膜淋巴结、主动脉、十二指肠、结肠、垂体、大脑皮质、小脑皮质中都有表达。其中,肝、半腱肌、下丘脑、胰、主动脉、垂体中InsR基因的表达量显著多于其他组织(P<0.05)。InsR基因在各组织中的广泛分布表明胰岛素在体内具有广泛的生理功能。     

绵羊痘病毒E3L基因在Vero细胞中的表达

为了构建组成型表达绵羊痘病毒E3蛋白的真核表达载体,并检测E3蛋白在Vero细胞中瞬时表达的情况,将绵羊痘病毒E3L基因亚克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-E3L,经酶切和测序鉴定正确后转染至Vero细胞,利用Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)对E3蛋白的表达水平进行鉴定。结果显示,转染后第48小时可检测到E3L基因高水平的表达。这一研究结果为进一步研究绵羊痘病毒E3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

日本血吸虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆表达及表达产物的免疫保护效果的评估

为掌握日本血吸虫钙调神经磷酸酶B亚基(CNB)特性并评估其作为候选疫苗分子的潜力,采用PCR方法扩增日本血吸虫CNB基因,构建重组质粒pET-28a(+)-CNB,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用His-Bind亲和层析纯化获得重组蛋白rCNB。Western-blot结果显示,rCNB能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别,具有较好的免疫原性。免疫组织化学分析表明,CNB主要分布在日本血吸虫虫体的睾丸、卵巢等生殖器官中,在表膜中也有少量分布。用重组蛋白rCNB结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,结果 rCNB诱导小鼠产生了27.93%(P0.05)的减虫率和42.93%(P0.01)的肝减卵率。结果表明,日本血吸虫CNB具有一定的免疫保护效果,为深入研究日本血吸虫钙调神经磷酸酶的生物学功能奠定了基础。