miR-275在长角血蜱不同发育阶段及组织中表达的动态变化

根据本实验室建立的高通量测序数据库中长角血蜱miR-275的成熟体序列信息,设计出特异性茎环引物及PCR扩增引物,同时以长角血蜱β-actin基因(GenBank登录号:AY254898)为内参基因,绘制标准曲线,计算长角血蜱miR-275的标准拷贝数,采用GraphPad Prism 5软件分析miR-275在长角血蜱不同发育时期及不同组织中的表达情况。结果显示,长角血蜱miR-275和β-actin标准曲线的回归系数均大于0.99,熔解曲线峰值单一,Ct值的变异率均小于5%,表明引物特异性好,标准曲线重复性和稳定性高。用real-time PCR方法对miR-275在长角血蜱卵的不同发育时期、蜱不同发育阶段及不同组织中的表达情况进行分析。结果显示,miR-275在长角血蜱卵发育到第16天的拷贝数最大,为(13.07±1.63)×106 copies/μL,是表达量最低的第5天的43.57倍;在饱血成蜱中拷贝数最多,为(18.95±1.55)×106 copies/μL,是饥饿成蜱的236.88倍;长角血蜱卵巢中拷贝数是最高的,为(15.29±3.59)×106 copies/μL,是表皮表达量的10.47倍。结果表明,miR-275在长角血蜱卵的发育、细胞增殖、组织分化等过程中可能起到了至关重要的作用。     

长角血蜱对牛大巴贝西虫的经卵传递试验研究

我国河南省卢氏县流行的牛的大巴贝西虫病,传播媒介为长角血蜱。本试验进一步证实,清洁的长角血蜱成虫饲喂在大巴贝西虫带虫的牛体上可被感染,病原能在饱血的雌蜱体内经卵传递,其第二代幼虫、若虫和成虫都具有将大巴贝西虫传递给易感牛的能力。微小牛蜱不能传播这种病原。     

实验室条件下长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生物学特性

在实验室条件下,对我国北方长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生活史进行了首次观察。研究发现,行孤雌生殖的长角血蜱为三宿主蜱;在兔体完成1个世代共需106~154 d,饥饿期的幼蜱、若蜱与两性生殖的饥饿幼蜱、若蜱体重的差异不显著(P>0.05),而饱血体重与两性生殖的长角血蜱种群饱血体重差异极显著(P<0.01);雌蜱饱血体重可达吸血前的108.46±19.72倍,与两性生殖的种群饱血体重差异亦极显著(P<0.01)。雌蜱产卵量与饱食体重之间呈极显著正相关r=0.897 0(P<0.01);生殖效率指数REI=6.76,生殖适合度指数RFI=6.29;蜱发育时间在不同季节无明显变化。     

牛大巴贝西虫在我国的发现及其媒介蜱的确定

首次在我国发现和分离出一株牛的大巴贝西虫并确定了其媒介蜱为长角血蜱。1988年4月,从河南省卢氏县同一群黄牛体上采集到长角血蜱饱血雌虫4只和微小牛蜱饱血雌虫16只,然后分别用其第二代幼虫、若虫和成虫感染除脾小牛。结果证明长角血蜱饱血雌虫能经卵传递大巴贝西虫,第二代幼虫对牛具有感染力,若虫和成虫不能感染。微小牛蜱的幼虫、若虫和成虫各期都不能传播这种巴贝西 虫。长角血蜱幼虫感染的小牛,红细胞内的虫体稍小于双芽巴贝西虫,大于牛巴贝西虫,双梨子形虫体较宽,其量度为3.1～3.7×1.5～2.3μm,长宽指数为1.87。     

长角血蜱Ykt6蛋白抗东方泰勒虫感染的生物学效应

为了解Ykt6基因在蜱体中影响东方泰勒虫感染的生物学效果,通过长角血蜱实验室培养株和野外株,评估Ykt6蛋白对东方泰勒虫侵染长角血蜱过程中蜱的存活率、繁殖率以及对东方泰勒虫感染率等指标的生物学效果。结果显示,Ykt6基因参与了东方泰勒虫与长角血蜱之间的宿主-寄生虫相互作用。Ykt6基因的表达水平与东方泰勒虫在长角血蜱体内的存活和繁殖能力密切相关,当该基因表达水平降低时,东方泰勒虫的存活率和繁殖能力显著下降。进一步的研究发现,Ykt6基因的变异可能影响东方泰勒虫与长角血蜱之间的相互作用。一些野外长角血蜱个体具有Ykt6基因的突变,导致东方泰勒虫在长角血蜱体内的存活和繁殖能力显著下降。这一发现提示,Ykt6基因的变异可能是东方泰勒虫入侵长角血蜱的一个关键因素。总之,Ykt6基因对东方泰勒虫入侵长角血蜱具有重要影响。通过研究Ykt6基因的功能和变异,可以深入了解东方泰勒虫与长角血蜱之间的相互作用,为控制东方泰勒虫入侵提供新的思路和方法。这将有助于保护人畜健康和生态环境的平衡。     

长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析

为构建长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,获得长角血蜱雄性成蜱在半饱血状态下的特异表达基因,用抑制消减杂交方法构建以pGEM-T Easy为载体的长角血蜱半饱血雄蜱全蜱cDNA文库,测序并进行生物信息学分析.以新合成的长角血蜱饥饿和半饱血雄蜱cDNA第一链为模板,用RT-PCR方法对从文库中挑选的5个表达序列标签(EST)进行鉴定.初步获得18个EST,BlastX分析显示,所得cDNA编码的功能性蛋白主要包括信号传导、组织形态形成、转录调节和糖类代谢等相关蛋白.RT-PCR鉴定结果显示,随机挑选的5个新EST中有3个在半饱血状态下差异表达.结果表明,成功地构建了长角血蜱雄性全蜱抑制消减杂交文库,获得了有潜在生物学功能的EST.     

几种蜱MLP基因的表达及其表达产物反应原性的分析

通过对饥饿的长角血蜱雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,以期获得长角血蜱MLP基因全长cDNA序列。设计通用引物,采用PCR方法分别从青海血蜱、麻点璃眼蜱、森林革蜱、微小牛蜱及小亚璃眼蜱中对MLP基因完整的开放阅读框进行了扩增,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性。结果表明,成功扩增了长角血蜱的MLP基因全长序列及多个蜱种的MLP基因开放阅读框序列,体外高效诱导表达了约39.2ku的不同蜱的MLP重组蛋白。Western-blot结果表明,长角血蜱的MLP重组蛋白具有很强的反应原性,且不同蜱的重组蛋白间具有很强的交叉反应性。     

森林革蜱Septin-2的原核表达及其免疫分析

为了了解森林革蜱Septin-2基因的结构、表达特征及生物学功能,通过对Septin-2基因进行克隆、原核表达及生物信息学分析,利用RT-qPCR方法检测该基因在森林革蜱不同发育时期以及不同组织间的表达丰度。结果显示,本实验室培养的森林革蜱庆阳株Septin-2基因中最大编码区为1 281 bp,可编码大小为426 aa的蛋白,主要功能区基因大小为868 bp,与森林革蜱陕西株（KAH7952853,XP＿037569269）的同一性最高,高达100%;森林革蜱Septin-2在卵巢中的表达丰度最高,且蜱饱血后的表达量明显高于饥饿状态的蜱,Septin-2基因能够表达37 ku的重组蛋白,并能被家兔抗森林革蜱血清识别。上述研究表明,Septin-2基因在蜱饱血及卵巢的发育过程中均表达。     

甘肃省宁县两种羊巴贝斯虫的传递试验

将采自甘肃省宁县湘乐镇柏树底村自然感染绵羊的含虫血，用液氮保藏，带回实验室后解冻，经颈部皮下以５０ｍＬ分别接种未除脾绵羊１只，除脾山羊１只。用采自疫区羊体的半饱血若虫和成虫（后经鉴定系森林革蜱和长角血蜱）、饱血若虫（在实验室蜕化为成虫，系长角血蜱）、森林革蜱次代幼虫，各自分别叮咬感染１只未除脾绵羊。结果含虫血接种的绵羊和山羊均被感染，在血液涂片中观察到了两种巴贝斯虫，一种是大型的巴贝斯虫未定种，另一种是小型的绵羊巴贝斯虫，潜伏期为９～１１ｄ。蜱叮咬的羊只均未感染成功。     

长角血蜱MLC基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为了解长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)肌球蛋白碱轻链(MLC)基因表达产物的免疫学活性,利用RT-PCR方法扩增了长角血蜱MLC基因的完整开放阅读框,将该基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中进行表达,在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导条件下,用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,该重组蛋白的表达分子质量为44ku。Western-blotting结果显示,MLC蛋白能被兔抗长角血蜱成蜱阳性血清识别,表明MLC蛋白具有良好的反应原性。     

长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。     

长角血蜱酸性磷酸酶全长cDNA的克隆与原核表达及其表达产物的酶活性分析

通过对长角血蜱饥饿雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,得到了长角血蜱酸性磷酸酶全长cDNA序列。利用生物信息学方法对该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了分析,同时构建了系统发育树。采用PCR方法扩增目的基因完整的开放阅读框,将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Wes-tern-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性,同时进行体外酶活性分析。结果表明,成功获得了长角血蜱酸性磷酸酶全长序列,体外高效诱导表达了约67.0 ku的重组蛋白。Western-blot表明该蛋白具有很强的反应原性,且在pH5.0时,该酶水解对硝基苯磷酸二钠的能力最强。     

图们江下游部分牧场硬蜱区系及生态特点调查

对图们江下游部分牧场黄牛体表寄生蜱调查表明，该地区的蜱有血蜱属长角血蜱（Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ）和硬蜱属全沟硬蜱（Ｉｘｏｄｅｓｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ），２种蜱分别占９３．２１％和６．７７％；黄牛的感染率为１００％，感染强度为１２１～３２７０只；在２个硬蜱生境地带２种蜱的分布基本相同。当地优势种长角血蜱在宿主体表的分布无规律性，但以宿主前躯寄生数量较多。长角血蜱的若虫、成虫每年５月中旬至６月上旬为活动盛期，这与该地区牛瑟氏泰勒虫病的发病季节一致。     

麻点璃眼蜱生活史的研究

在实验室条件下 ,将麻点璃眼蜱 (Hyalommarufipes)幼蜱至若蜱置于牛体或兔体、成蜱置于羊体摄食 ;若蜱蜕化、饱血雌蜱产卵和孵化在 2 8℃、相对湿度约 80 %的培养箱中完成。在此条件下 ,对从甘肃省永靖县羊体获得的麻点璃眼蜱在实验室进行了生活史研究。试验证实 ,该种蜱为二宿主蜱 ,一个生活周期需要经过幼蜱、若蜱、成蜱和卵 4个发育阶段。幼蜱 5～ 7d饱血 ,蜕化为若蜱后不离开前一变态期蜱的寄生部位 ,继续在宿主体上叮咬吸血 ,经 14～ 2 4d若蜱饱血脱落。若蜱蜕化期为 18～ 63d ,平均 40 .5d。雌蜱饱血需 8～ 16d ,平均 12 .0d。雌蜱产卵前静止期 6～ 43d ,产卵期 16～ 2 9d ,平均 2 2 .5d。卵经 2 0～ 41d孵出幼蜱 ,平均 3 1.5d。该种蜱在实验室完成一个生活周期需要 91～ 2 2 6d     

长角血蜱的免疫研究进展

以长角血蜱疫苗候选抗原为例,从长角血蜱蛋白水解酶、蜱生殖和发育相关分子及RNA干扰技术、IgG结合蛋白技术几方面概述了近年来国内外有关蜱疫苗的研究现状,并展望了蜱疫苗的发展趋势。     

甘肃省羊泰勒虫媒介蜱的传播试验

用采自羊泰勒虫病疫区甘肃省永靖县的麻点璃眼蜱饥饿成虫叮咬健康羊体,试验羊体内未发现羊泰勒虫;用其饱血雌虫孵化的幼虫叮咬羊泰勒虫感染羊,收集饱血若虫,再用其饥饿成虫叮咬健康羊体,被叮咬羊体内也未查出羊泰勒虫,证明麻点璃眼蜱不传播羊泰勒虫.用采自羊泰勒虫病疫区张家川和永靖县的青海血蜱经人工孵化的幼虫叮咬羊泰勒虫自然感染羊,收集饱血幼虫蜕皮后,用其若虫叮咬健康羊,40 d后在被叮咬羊血片中发现羊泰勒虫,但未显示明显的临床症状.用采自羊泰勒虫病疫区羊体的青海血蜱成虫、若虫、幼虫同时叮咬健康羊,18 d时在试验羊体内发现羊泰勒虫,试验羊表现贫血、黄疸、稽留热、肩前淋巴结肿大等特征性症状,出现心包积液,肝、脾、肾肿胀及出血的典型病理变化.由此确定,甘肃省的羊泰勒虫是由青海血蜱传播的.     

刻点血蜱生活史的研究

对从新疆伊宁县和霍城县牛、羊体获得的刻点血蜱在实验室进行了生活史观察，实验证实刻点血蜱为三宿主蜱，一个生活周期为１０７～１７３天，一年发生一个世代。饱血雌蝉的产卵前期和产卵期随温度的不同而有差异，在２８℃时分别为４～８天和２４～３２天。卵为椭圆形，大小为０．３２～０．４２ｍｍ×０．４７～０．５７ｍｍ，孵化期为３３～３８天。幼蜱吸血期为７～１４天，蜕变期为１０～１９天，若蜱吸血期为６～１５天，蜕变期为９～１９天，雌蜱吸血期为１２～１７天。６～７月份饱血雌蜱部分发生生殖滞育，８月份以后饱血者则全部发生滞育，９月份以后饱血的若蜱也发生滞育，表现为变态延迟。饥饿成蜱在１０月份以后饲喂在动物体时，发生行为滞育和摄食滞育。各个发育阶段都有较强的耐饥饿能力，在室温下，幼蜱生存１３０～２２０天，若蜱２１０～３８０天，成蜱２４０～６００天。     

七种药物对微小牛蜱的半数致死浓度测定

用浸渍法测定了楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤、高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、哒嗪酮、螨净 7种药物对未吸血的微小牛蜱 (Boophilusmicroplus)幼蜱、若蜱、成蜱及其饱血雌蜱的半数致死浓度(LC50 )。结果显示 ,所用药物中半数致死浓度最低的 3种药物是楝素、三氟氯氰菊酯、苦皮藤。植物性杀虫剂楝素对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为3.0 1～ 3.13、4 .37～ 4 .77、11.18～ 11.36、2 75 .5 0～ 2 76 .5 0mg/L ;植物性杀虫剂苦皮藤对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 4 .2 2～ 4 .4 2、10 .30～ 10 .5 0、82 .5 0～82 .70、6 35 .30～ 6 36 .70mg/L ;人工合成的除虫菊酯类的三氟氯氰菊酯对未吸血微小牛蜱的幼蜱、若蜱、成蜱及饱血雌蜱的半数致死浓度分别为 3.4 2～ 3.4 4、7.10～ 9.0 6、4 2 .30～ 4 2 .5 0、5 45 .5 0～5 46 .70mg/L。     

牛血孢子虫单一种的分离技术及其保藏方法的研究——牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫在其媒介蜱血淋巴中的裂殖子观察

将洁净微小牛蜱幼虫和长角血蜱饥饿成虫分别饲喂到人工感染牛巴贝斯虫和卵形巴贝斯虫单一种的牛体上,收集脱落饱血雌虫培育,逐日用断腿法制作血淋巴涂片观察。结果微小牛蜱脱落后第4天的血淋巴中,就观察到了牛巴贝斯虫的游离大裂殖子,其形态似压扁的圆锥体,前端大而钝,后端小而尖,有的尖端稍弯曲或弯曲如钩状。虫体中央有1～3个圆形的核,绝大多数为1个。原生质中有数目不等的空泡,大小为9.0～22.0×1.5～6.0μm,平均13.6×3.14μm。另有圆环形、逗点形、蝌蚪形及其它形态的裂殖子,大多周边布有染色质带,中央往往呈现出一个大空泡。在脱落后第4天的个别长角血蜱的血淋巴涂片中,就可查到大裂殖子,直到第20天,存活蜱的涂片中还可检出。蜱全部获得感染,但虫体出现的时间不规律,仅在少数蜱的涂片中可连续观察到。其形态与上述牛巴贝斯虫血淋巴中典型大裂殖子相似。大小为10.0～19.0×1.5～4.5μm,平均13.84×3.72μm。     

对鸡觅食长角血蜱习性的观察

蜱可吸食家畜的血液和向血液中分泌毒素 ,使红细胞减少 ,家畜呈现消瘦、贫血、困乏和衰弱 ;蜱又是一些传染病和寄生虫病的传播媒介 ,如牛、羊泰勒虫病等。辽宁省朝阳市侵袭牛、羊的蜱主要为长角血蜱 ,每年在蜱活动季节多采取人工捕捉、喷洒杀虫药及限制到蜱多的牧地放牧等办法防治蜱的侵袭 ,但这些办法都有一定的局限性。生物灭蜱是很有前途的方法 ,国内文献中有用白僵菌对残缘璃眼蜱杀灭作用的试验 ,但未见其他生物灭蜱的报道。笔者通过观察 ,发现鸡有觅食长角血蜱的习性 ,为此进行进一步试验。鸡对离体长角血蜱觅食习性的观察　 2 0 0 1年…