长角血蜱三种miRNAs在不同发育阶段和器官中的表达分析

为了研究长角血蜱体内miRNAs的生物学功能,本研究从饱血后差异表达的miRNAs中筛选了3种miRNAs(mi R-278,Let-7和Bantam),采用荧光定量PCR方法检测了3种miRNAs在蜱的各个发育阶段和成蜱四种不同器官中的表达量;经miRNAs化学拮抗剂的注射,进行相应miRNAs的干扰试验。结果显示,在蜱体内获得了miRNA-278,Let-7和Bantam的前体序列,三种miRNAs的表达量在饱血后存在差异,在若蜱和成蜱的脂肪体中表达量最高,但Bantam表达量在各个阶段均较miR-278和Let-7低。结果表明,3种miRNAs的表达具有阶段和器官特异性,miR-278对长角血蜱成蜱的上体率和致死率影响显著。本研究可为抗蜱新药或疫苗的研发提供新的途径。     

几种蜱MLP基因的表达及其表达产物反应原性的分析

通过对饥饿的长角血蜱雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,以期获得长角血蜱MLP基因全长cDNA序列。设计通用引物,采用PCR方法分别从青海血蜱、麻点璃眼蜱、森林革蜱、微小牛蜱及小亚璃眼蜱中对MLP基因完整的开放阅读框进行了扩增,并将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,分别用SDS-PAGE和Western-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性。结果表明,成功扩增了长角血蜱的MLP基因全长序列及多个蜱种的MLP基因开放阅读框序列,体外高效诱导表达了约39.2ku的不同蜱的MLP重组蛋白。Western-blot结果表明,长角血蜱的MLP重组蛋白具有很强的反应原性,且不同蜱的重组蛋白间具有很强的交叉反应性。     

猪细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为研究miRNA在猪细小病毒(PPV)复制中的作用机制,针对PPV的NS1基因设计引物,建立了实时荧光定量PCR;用RegRNA软件和RNAhybrid软件预测能靶向PPV基因组的miRNA,将筛选出的miR-34a与miR-181a、miR-16、miR-499-5p、miR-10b、miR-18a、miR-145-5p分别转染到PK-15细胞,然后用PPV感染细胞,每隔12h取细胞上清,用实时荧光定量PCR检测PPV的DNA拷贝数。结果显示,实时荧光定量PCR的最适退火温度为59℃,熔解温度在85℃左右,质粒浓度在1.59×109~1.59×104 copies/μL时可得到较为理想的标准曲线,相关系数为0.997,扩增效率为97.2%。用该实时荧光定量PCR对日本脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行检测时均无荧光信号,表明具有良好的特异性。转染不同miRNA的细胞感染PPV后,用建立的实时荧光定量PCR检测发现miR-34a能抑制PPV的复制,其他miRNA对PPV增殖无明显影响。     

猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFRl和TNF-αSYBR Green Ⅰ real-time PCR检测方法的建立

分别针对猪凋亡细胞因子Fas、FasL、TNFR1、TNF-α基因以及看家基因β-actin的序列设计了1对特异性引物,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测Fas、FasL、TNFR1、TNF-α及β-actin的SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法.该方法线性关系好(r2≥0.995),敏感性高,初始模板的检出下限除TNFR1为1×102 copies/μL外,其他均为1×101 copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性熔解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%.应用所建立的方法对猪生殖与呼吸综合征病毒感染仔猪外周血单个核细胞中Fas、FasL、TNFRl和TNF-α mRNA的表达水平进行了检测.结果表明,建立的real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好.     

实验室条件下长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生物学特性

在实验室条件下,对我国北方长角血蜱甘肃株孤雌生殖种群的生活史进行了首次观察。研究发现,行孤雌生殖的长角血蜱为三宿主蜱;在兔体完成1个世代共需106~154 d,饥饿期的幼蜱、若蜱与两性生殖的饥饿幼蜱、若蜱体重的差异不显著(P>0.05),而饱血体重与两性生殖的长角血蜱种群饱血体重差异极显著(P<0.01);雌蜱饱血体重可达吸血前的108.46±19.72倍,与两性生殖的种群饱血体重差异亦极显著(P<0.01)。雌蜱产卵量与饱食体重之间呈极显著正相关r=0.897 0(P<0.01);生殖效率指数REI=6.76,生殖适合度指数RFI=6.29;蜱发育时间在不同季节无明显变化。     

蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒半巢式PCR检测方法的建立

为建立快速、敏感的蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)检测方法,根据GenBank中已登录的蜱源LCMV NP基因序列设计半巢式PCR引物,通过优化反应条件建立半巢式PCR检测方法。结果显示,用该方法能扩增出248 bp的目的片段,与LCMV序列(MG554174)的同源性为100%。特异性试验结果显示,该方法对蜱传脑炎病毒、发热板血小板减少综合征病毒、阿龙山病毒的基因扩增无条带。敏感性试验结果显示,该方法最低可以检出0.45×10~2copies/μL的蜱源LCMV NP蛋白基因,是普通PCR的1 000倍。对总数为150只森林革蜱、草原革蜱和全沟硬蜱样品的检测发现,半巢式PCR、普通PCR的检出率分别是18%和0。蜱源LCMV半巢式PCR方法的建立为蜱源淋巴细胞脉络丛脑膜炎的防控提供了技术支持。     

长角血蜱4D8基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的蜱4D8基因序列设计引物,用PCR技术从长角血蜱雌蜱研磨组织cDNA中扩增出4D8基因,将其连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T-4D8,并对检测为阳性的克隆进行测序。将该基因重组至原核表达载体pGEX-4T-1,经表达纯化后,进行Western-blot试验鉴定其生物学活性。结果,长角血蜱4D8基因的氨基酸序列与青海血蜱、肩突硬蜱的同源性分别为90%、81%。表达的重组蛋白是分子质量约为41ku的融合蛋白。Western-blot试验证明,该重组蛋白能很好地识别兔抗长角血蜱全蜱阳性血清。结果表明,4D8基因作为一种重要的分子标记基因在蜱的流行病学调查方面有着重要的价值,同时作为潜在的候选抗原基因在疫苗的研究方面也有重要意义。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10~2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10~4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。     

致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、特异、快速地检测食品中致病性沙门菌的方法,针对沙门菌致病性菌株特有的invA基因设计引物,PCR扩增目的片段,构建重组质粒pMD19-T-inv285,将其作为标准品进行real-time PCR反应体系的优化和标准曲线的绘制,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测;同时用该方法对90份肉品样品进行检测。结果显示,建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程为y=-3.397 1 x+27.313,相关系数r2=0.999 6。该方法的灵敏度为5×100copies/μL,是普通PCR(5×102 copies/μL)的100倍。对10种常见食源性细菌的检测结果均为阴性;组内和组间重复试验的变异系数均低于1%。对90份肉品样品的检出率(6/90,6.67%)显著高于快速MALDI-TOF-MS法和传统的细菌分离鉴定方法(均为3/90,3.33%)。结果表明,本试验建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于食品中致病性沙门菌的快速检测。     

长角血蜱MLC基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为了解长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)肌球蛋白碱轻链(MLC)基因表达产物的免疫学活性,利用RT-PCR方法扩增了长角血蜱MLC基因的完整开放阅读框,将该基因连接到原核表达载体pGEX-4T-1中进行表达,在37℃、1.0mmol/L IPTG诱导条件下,用SDS-PAGE分析目的蛋白的表达情况。结果表明,该重组蛋白的表达分子质量为44ku。Western-blotting结果显示,MLC蛋白能被兔抗长角血蜱成蜱阳性血清识别,表明MLC蛋白具有良好的反应原性。     

牛大巴贝西虫在我国的发现及其媒介蜱的确定

首次在我国发现和分离出一株牛的大巴贝西虫并确定了其媒介蜱为长角血蜱。1988年4月,从河南省卢氏县同一群黄牛体上采集到长角血蜱饱血雌虫4只和微小牛蜱饱血雌虫16只,然后分别用其第二代幼虫、若虫和成虫感染除脾小牛。结果证明长角血蜱饱血雌虫能经卵传递大巴贝西虫,第二代幼虫对牛具有感染力,若虫和成虫不能感染。微小牛蜱的幼虫、若虫和成虫各期都不能传播这种巴贝西 虫。长角血蜱幼虫感染的小牛,红细胞内的虫体稍小于双芽巴贝西虫,大于牛巴贝西虫,双梨子形虫体较宽,其量度为3.1～3.7×1.5～2.3μm,长宽指数为1.87。     

肉食兽类细小病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立检测肉食兽类细小病毒荧光定量PCR方法和探索细小病毒基因组拷贝数与病毒含量之间的相关性,在肉食兽类细小病毒VP2基因区分别设计了1对保守引物和1条TaqMan-MGB标记的水解探针,通过对貉细小病毒(RDPV)LN10-1株VP2基因上的长度为92bp的保守片段进行PCR扩增,构建标准重组质粒,由已知浓度的重组质粒通过荧光定量PCR体系建立标准曲线,建立了检测肉食兽类细小病毒基因组拷贝数的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在3.50×102～3.50×107 copies/μL范围内与Cp值呈良好的线性关系(R2可达0.999),最低检测浓度为35.0copies/μL。通过标准曲线得出RDPVLN10-1株样品的目标片段拷贝数,将拷贝数值与TCID50值进行相关性分析;分析结果显示,基因组拷贝数值与病毒TCID50值之间存在极显著的正相关关系(P<0.01),血凝效价与病毒TCID50值存在显著的正相关关系(P<0.05)。结果表明,与用血凝效价测定病毒含量的方法相比,用本试验建立的荧光定量PCR技术测得的病毒拷贝数值更能准确地代表活病毒的含量。     

猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据伪狂犬病病毒gD、gE基因序列设计2对引物及其对应的探针,通过对引物、探针浓度的优化,建立了猪伪狂犬病病毒野毒和减毒活疫苗株荧光定量PCR检测鉴别方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪博卡病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无扩增曲线。野毒株均出现gD和gE基因扩增曲线,而疫苗株只出现了gD基因扩增曲线,表明该检测方法具有良好的特异性。建立的gD和gE基因标准曲线Ct值和模板终浓度在1×108～1×10 copies/μL范围内均具有良好的线性关系,灵敏度均可达1×10 copies/μL。对39份猪组织样品进行检测,荧光定量PCR检出5份样品猪伪狂犬病病毒gD、gE阳性,表明这5份猪组织样品为猪伪狂犬病病毒野毒感染。常规PCR检出5份猪伪狂犬病病毒阳性,经测序为野毒感染,2种方法符合率为100%。本研究建立的荧光定量PCR可用于猪伪狂犬病病毒的快速检测和流行病学调查。     

长角血蜱的免疫研究进展

以长角血蜱疫苗候选抗原为例,从长角血蜱蛋白水解酶、蜱生殖和发育相关分子及RNA干扰技术、IgG结合蛋白技术几方面概述了近年来国内外有关蜱疫苗的研究现状,并展望了蜱疫苗的发展趋势。     

长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库的构建与分析

为构建长角血蜱雄蜱抑制消减杂交cDNA文库,获得长角血蜱雄性成蜱在半饱血状态下的特异表达基因,用抑制消减杂交方法构建以pGEM-T Easy为载体的长角血蜱半饱血雄蜱全蜱cDNA文库,测序并进行生物信息学分析.以新合成的长角血蜱饥饿和半饱血雄蜱cDNA第一链为模板,用RT-PCR方法对从文库中挑选的5个表达序列标签(EST)进行鉴定.初步获得18个EST,BlastX分析显示,所得cDNA编码的功能性蛋白主要包括信号传导、组织形态形成、转录调节和糖类代谢等相关蛋白.RT-PCR鉴定结果显示,随机挑选的5个新EST中有3个在半饱血状态下差异表达.结果表明,成功地构建了长角血蜱雄性全蜱抑制消减杂交文库,获得了有潜在生物学功能的EST.     

猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够准确、快速地鉴别猪肠病毒G型的诊断方法,本研究参考猪肠病毒G型的3D基因序列设计1对特异性引物,扩增片段预计大小约为104 bp,将3D基因片段克隆到pMD18-T载体上的阳性重组质粒作为标准品,建立猪肠病毒G型的实时定量PCR检测方法,并应用到临床样品的检测。研究结果显示,该方法设计的引物具有高度的特异性;标准曲线的Cq值与质粒标准品模板在2.92×10^8copies/μL^2.92×10^2copies/μL范围内,呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-4.023;组内与组间重复性试验显示变异系数很小,在0.26%~1.57%之间。该方法的最低检测限量可达2.92×10 copies/μL。使用本方法对2017-2019年广西部分地区的猪场临床腹泻粪便样品进行检测,猪肠病毒G型阳性检出率为18.42%,说明广西部分地区的猪场存在猪肠病毒G型的感染。本研究成功建立了猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法,可用于猪肠病毒G型感染的临床检测。     

含扩增内标的犬巴贝斯虫PCR检测方法的建立

为了提高犬巴贝斯虫的PCR检测方法准确性,采用复合引物重组方法构建两端含有检测巴贝斯虫18S r RN A基因的PCR检测引物的扩增内标质粒(含鸡特异性基因片段),通过优化扩增内标质粒的添加量,建立了一种新的检测犬巴贝斯虫PCR方法。结果显示,在25 L的PCR反应体系中加入1×106copies的扩增内标的可有效地检测犬巴贝斯虫基因组D NA,该PCR方法最低检测限为1×105copies。本试验建立的含扩增内标的PCR检测方法能快速、准确、简便的检测犬巴贝斯虫感染,同时能有效的避免假阴性现象的产生。     

家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为快速检测家畜嗜衣原体,选取家畜嗜衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因的高度保守区域,设计特异性引物和探针,通过对反应条件的优化,建立家畜嗜衣原体TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的最低检测限为2.8×10copies/μL,在2.8×102~2.8×106 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其标准曲线方程为y=-3.281 5x+41.396,线性相关系数r2=0.999 4,扩增效率为101.7%;该方法可特异性检测家畜嗜衣原体,对肺炎嗜衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热嗜衣原体、流产嗜衣原体等6种动物衣原体无交叉反应,特异性好;其批间重复试验和批内重复试验的变异系数分别为0.170 2%~0.467 2%、0.331 4%~2.796%,重复性良好。采用本试验建立的方法与OIE推荐的方法进行比较,二者的结果表现出良好的符合率。该方法的建立为家畜嗜衣原体的早期检测和流行病学调查提供了有效的检测手段。     

绵羊肺炎支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种灵敏性高、特异性强的检测绵羊肺炎支原体的TaqMan实时荧光定量PCR方法。根据GenBank上已发表的绵羊肺炎支原体HSP70基因序列设计引物和探针,构建标准阳性质粒,建立实时荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法标准曲线的线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=1.000,斜率S=-3.334,扩增效率E=99.5%;敏感性高,可以检测出的最低样品浓度为1×101copies/L,是普通PCR的100倍;特异性强,能有效区分巴氏杆菌等9种病原;重复性好,组内、组间的Ct值变异系数均小于2%。运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法可简便、准确地鉴定绵羊肺炎支原体。     

长角血蜱酸性磷酸酶全长cDNA的克隆与原核表达及其表达产物的酶活性分析

通过对长角血蜱饥饿雌性成蜱cDNA表达文库中筛选到的未知基因进行5′RACE扩增,得到了长角血蜱酸性磷酸酶全长cDNA序列。利用生物信息学方法对该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了分析,同时构建了系统发育树。采用PCR方法扩增目的基因完整的开放阅读框,将其克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒,转入BL21(DE3)中,经IPTG进行诱导表达,分别用SDS-PAGE和Wes-tern-blot分析目的蛋白的表达情况和反应原性,同时进行体外酶活性分析。结果表明,成功获得了长角血蜱酸性磷酸酶全长序列,体外高效诱导表达了约67.0 ku的重组蛋白。Western-blot表明该蛋白具有很强的反应原性,且在pH5.0时,该酶水解对硝基苯磷酸二钠的能力最强。