犬细小病毒的新型原液荧光定量PCR方法的建立

为建立一种不提取病毒DNA,直接采用样本上清液检测犬细小病毒(CPV)的TaqMan荧光定量PCR方法,通过扩增CPV NS基因部分片段构建重组质粒,建立TaqMan荧光定量PCR方法;对建立的方法进行反应条件、特异性、敏感性的检测;通过建立的方法对核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR进行对比;最后对临床中疑似的CPV病例进行检测。结果显示,建立的方法特异性好,对犬常见病毒无扩增。该方法检测的灵敏度达101copies/L,该方法的批内变异系数为0.09%~1.30%,批间变异系数为0.57%~0.94%,重复性良好。核酸荧光定量PCR和原液荧光定量PCR的最低检测浓度均可以达到101 copies/L,且原液荧光定量PCR的产物浓度约为核酸荧光定量PCR的7倍,提示核酸在提取过程中有大量的损耗。对187份临床病料进行检测,建立的方法共检出128份阳性,与普通PCR和胶体金快速检测板的阳性符合率均为100%,核酸法与原液法的符合率为100%。因此,本试验建立的CPV病料原液TaqMan荧光定量PCR方法与普通PCR和胶体金快速检测板相比,具有阳性检出率更高、准确率更好的特点。     

犬细小病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

参照GenBank中犬细小病毒(CPV)VP2基因保守区域序列设计合成特殊的内、外引物,在扩增反应体系中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,通过恒温荧光检测仪Deaou-308C扩增检测,建立了一种快速检测CPV的实时荧光环介导等温扩增(LAMP)方法。结果显示,这种方法对CPV具有特异性的扩增反应,对照病毒核酸的扩增结果均为阴性。灵敏度试验最低可检出3.72 copies/μL的病毒核酸。重复性试验结果表明,其检测重复性良好。对30份临床宠物犬的粪便样品进行检测,与免疫胶体金检测试纸方法进行比较,符合率为90%。将本方法初步应用于大熊猫粪便中犬细小病毒的检测,结果表明,从大熊猫基地采集的84份粪便样品中有16份为细小病毒阳性,阳性率为19.0%。本方法在63℃下恒温45 min可以完成检测,操作简单、灵敏度高、特异性强,通过恒温实时荧光检测仪可实时检测及自动判读检测结果,对大熊猫的早期诊断非常重要。     

犬细小病毒SH14株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

为分离犬细小病毒(canine parvovirus,CPV),用疑似犬CPV感染的病犬肠组织研磨液接种猫肾细胞(CRFK),进行病毒分离,并利用常规病毒学和分子生物学方法以及动物回归试验鉴定分离的病毒,并对其VP2基因序列进行测定及分析。结果显示,该病毒能在CRFK细胞上良好生长并产生细胞变圆、脱落等特征性细胞病变;细胞培养物能扩增出CPV的特异性基因组;对病毒的VP2基因序列和推导的氨基酸序列进行分析,结果表明,本研究的分离毒株属于New CPV-2a型,与CPV SH-2/2011株的亲缘关系最近,其核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为99.83%和100%。上述结果表明,成功分离到1株New CPV-2a型犬细小病毒,将其暂命名为SH14株。本研究结果为进一步研究我国犬细小病毒的进化和变异,以及疫苗的研制奠定了物质基础。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1/R1和GPVF1/R1,建立了一种PCR方法,用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果,引物MDPVF1/R1仅特异性扩增出MDPV的900 bp核酸片段,引物GPVF1/R1仅特异性扩增出GPV的465 bp核酸片段。表明,建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

藏獒源犬细小病毒的分离鉴定

为弄清犬细小病毒(CPV)在藏獒中的流行情况,将临床上经胶体金试纸检测为阳性的藏獒直肠棉拭子8份处理后接种猫肾传代细胞(F81细胞),分离到6株病毒,对其进行了血凝试验(HA)、半数组织培养物感染剂量(TCID50)的测定,理化性质鉴定,提取分离株DNA并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其一特异性片段和VP2全序列,并与GenBank上登录的CPV毒株进行比对。结果表明,接毒后第6～13天在F81细胞上出现了明显的细胞病变(CPE),表现为细胞融合、变圆或拉长;所得分离株能使猪红细胞发生凝集反应,血凝效价为27～211;能抗酸(pH3)、热(60℃)、200mL/L乙醚、480mL/L氯仿;从细胞培养物中分别扩增出与特异性片段825bp一致以及与VP2全基因1 755bp一致的条带。将扩增的VP2序列与GenBank上登录的HQ883267.1、FJ222823.1、FJ005214.1等10个国内外CPV分离株的VP2序列进行比对;结果显示,与北京地区一分离株(HQ883267.1)的同源性最高,为99.0%～99.6%。所得分离株为不同毒株,但均为CPV-2a型。     

犬瘟热病毒RT-nested PCR检测方法的建立与应用

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计了套式引物,建立了RT-nested PCR检测方法。特异性试验表明,该法可以特异扩增出CDV NP基因片段,但从RNA病毒狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、犬冠状病毒(CCV),DNA病毒犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)及正常Vero细胞中均不能扩增出条带。敏感性试验表明,RT-PCR可以扩增10-6稀释度的病毒RNA,而建立的RT-nested PCR可以扩增到10-9稀释度的病毒RNA,后者的敏感性明显高于前者。用RT-nested PCR法检测了2006年我国东北地区临床表现犬瘟热症状的病例19例,检出率达90%,明显高于RT-PCR的检出率(45%)。部分病例扩增片段的测序结果表明,CDV NP基因出现个别碱基变异。研究结果表明,建立的犬瘟热病毒RT-nested PCR方法敏感、特异,适用于动物犬瘟热的快速诊断。     

CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列、犬细小病毒(CPV)VP2基因序列和犬冠状病毒(CCV)M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV(193 bp)、CDV(500 bp)和CCV(780bp)的多重纳米PCR(nano-mPCR)检测方法,同时考查所建立nano-mPCR检测方法的特异性和敏感性。结果表明,该方法特异性和敏感性良好,对CPV、CDV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10~2、6.0×10~2和6.7×10~2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。临床样品的检测结果表明,nano-mPCR的建立为CDV、CPV和CCV的单独或混合感染进行早期快速、灵敏、准确的鉴别诊断提供了新方法。     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

牛星状病毒及牛环曲病毒双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立能同时快速检测牛星状病毒(bovine astrovirus,BAstV)和牛环曲病毒(bovine torovirus,BToV)的方法,本研究根据BAstV的ORF1a和BToV的S基因的保守区域分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测BAstV和BToV的双重RT-PCR方法。特异性结果显示,该方法与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRo V)、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKoV)无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对BAstV和BToV质粒标准品的最低检出下限分别为1.12×10~4copies/μL和1.0×10~3copies/μL。应用该方法和各病原RT-PCR方法同时对221份河南省犊牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示BAstV的阳性率为18.1%,BToV的阳性率为19%,其中BAstV和BToV共感染的阳性率为6.79%,双重RT-PCR方法和各病原RT-PCR方法的符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重RT-PCR方法可用于BAstV和BToV的病原监测及流行病学调查。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒和鸭瘟病毒一步法二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种能同时检测Ⅰ型鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus typeⅠ,DHV-Ⅰ)和鸭瘟病毒(duck plague virus,DPV)的检测方法,根据Gen Bank中DHV-Ⅰ和DPV的基因保守序列,设计合成两对特异性引物,扩增得到DHV-Ⅰ和DPV片段,大小分别为399 bp和232 bp。据此建立了双重PCR检测方法,并将反应条件进行了优化。结果显示,该方法特异性强,能同时扩增出DHV-Ⅰ和DPV目的条带,而对其他常见的水禽病病原的扩增结果均为阴性。该方法灵敏度高,最低能检出5.3 pgⅠ型鸭肝炎病毒和2.7 pg鸭瘟病毒的RNA或DNA。采用该方法对在江苏省徐州地区所采集的166份鸭肛拭子进行检测,DHV-Ⅰ阳性率为1.2%;DPV阳性率为26%。同时,利用该方法对建立的DHV-Ⅰ和DPV雏鸭感染模型的肝组织和肝组织接种的鸭胚尿囊液进行检测,结果均为阳性,与常规PCR和RT-PCR检测结果一致。上述结果表明。本研究建立的一步法二重RT-PCR方法可以用于DHV-Ⅰ和DPV快速准确的诊断。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

犬细小病毒JL-(18)1/Beagle株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究犬细小病毒(CPV)流行株遗传变异情况,本研究从吉林省某比格犬养殖场采集疑似CPV感染致死犬的肠道组织,将病料接种至F81细胞进行病毒分离,并通过电镜形态学、PCR、血凝试验及动物回归试验进行鉴定。结果显示,所分离的这株病毒在F81细胞中产生了典型CPV细胞病变(CPE);在电镜下可见病毒呈无囊膜、直径为20 nm左右的病毒粒子;PCR鉴定证实CPV核酸呈阳性;血凝试验表明此病毒对猪红细胞具有凝集作用,血凝效价为1∶256;将这株病毒命名为JL-(18)1/Beagle。动物回归试验表明,JL-(18)1/Beagle使比格犬产生犬细小病毒感染的典型临床症状;以NS1基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与CPV-2c型分离株CPV-SH1516以及Canine/China/23/2017 NS1基因亲缘关系较近,而核苷酸相似率为100%;以VP2基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与New CPV-2b型CPV/CN/JL3/2013、CPV/CN/HB1/2013和CPV/CN/JL6/2013亲缘关系较近,核苷酸相似率为99.89%~99.94%;以VP2蛋白氨基酸进行序列分析表明,JL-(18)1/Beagle属于New CPV-2b型,与近期吉林CPV分离株相比,关键氨基酸位点无明显变化。因此,本试验从吉林省比格犬肠组织中分离到1株New CPV-2b型CPV毒株。     

水禽3种免疫抑制性病毒多重PCR检测方法的建立与应用

禽流感病毒 H9 亚型(AIV-H9)、鹅圆环病毒(GoCV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)是水禽常见病原,常发生混合感染且易导致水禽的免疫抑制性疾病。 本研究针对 AIV-H9、GoCV 和 MDRV 的基因序列,分别设计特异性引物,通过优化多重 PCR 的反应条件,建立了这 3 种病毒的多重 PCR 检测方法,并进行特异性、灵敏度和可重复性验证。 结果显示,建立的三重 PCR 检测方法能特异性扩增 AIV-H9、GoCV 和 MDRV的目的片段,与新型鹅星状病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽腺病毒 4 型无交叉反应;最低检出浓度分别为2.93×10⁴copies/ μL、2.5×10²copies/ μL、3.0×10⁶copies/ μL;利用该方法对 30 份临床样品进行检测,MDRV检出率为 6.7%,GoCV 和 AIV-H9 的检出率较高,分别为 36.7%和 26.7%。 三重 PCR 与单重 PCR 的符合率为 100%。 结果表明,该三重 PCR 检测方法特异、灵敏、稳定性好,能够用于这 3 种病毒的流行病...     

塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时快速鉴别检测塞内卡病毒A(SVA)和脑心肌炎病毒(EMCV)的方法,根据SVA和EMCV高度保守的3D基因区域,分别设计了2对特异性引物和带2种不同发光基团标记的TaqMan探针,建立同时检测这2种病毒核酸的双重TaqMan荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化。结果显示,该检测方法对SVA和EMCV的最低检测量分别为760 copies/μL和98 copies/μL,并且能够特异性检测出SVA和EMCV,而对猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等检测结果均为阴性。本方法中所建立的标准曲线呈现良好的线性关系,重复性试验组内和组间变异系数均低于5%,说明该检测方法重复性高。本研究所建立的双重荧光定量PCR具有方便、快速、特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,能够用于SVA和EMCV的同时检测。     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒(CPV)VP2蛋白基因序列,设计并合成1对引物,通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET-30a载体中,构建了原核表达载体pET-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白,Western-blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原,通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15.8 ng/孔,血清的最佳稀释倍数为1∶100,建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

猪库布病毒纳米PCR快速检测方法的建立

为了给临床检测猪库布病毒(PKV)提供更加准确便捷的检测方法,本试验设计了1对特异性引物,扩增PKV基因组的VP0区域。在传统PCR反应体系中添加纳米金颗粒材料,优化后建立了一种方便快捷且特异检测PKV的nano-PCR方法。结果显示,该方法能特异性扩增猪库布病毒,与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒均无交叉反应。nano-PCR相对于普通PCR表现出更高的敏感性,普通PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-7ng/μL,而nano-PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-10ng/μL,敏感性提高了1 000倍。对来自不同发病猪场30份腹泻猪的粪便和血液临床样本的检测结果显示,nano-PCR阳性检出率为23.33%(7/30),普通PCR阳性检出率为16.66%(5/30)。结果表明,本试验建立的nano-PCR方法在猪库布病毒的检测中表现出更高的特异性和敏感性,对猪库布病毒的快速诊断和检测具有重要的临床意义。     

山羊痘病毒及口疮病毒ITR-059基因双重PCR检测方法的建立

为实现山羊痘病毒(GTPV)和口疮病毒(ORFV)的同步快速检测,基于GTPV的ITR基因及ORFV的059基因,分别设计用于普通双重PCR的引物2对、用于二联实时荧光定量PCR的特异性引物及探针2套;探针分别用5′JOE-Eclipse3′及5′FAM-TAMRA3′荧光染料标记物进行标记。结果显示,所建立的GTPV-ITR-L-ORFV-059双重普通PCR方法,可实现对GTPV与ORFV的特异性双重检测,检测敏感度可达10~4copies/μL DNA;所建立的ITR-059二联探针实时荧光定量PCR方法可同时特异性检测ORFV和GTPV产生特异性荧光信号,二联探针的检测敏感度可分别达10~(2.87)和10~(2.52) copies/μL DNA。本研究初步建立了可同步特异性检测GTPV和ORFV的双重普通PCR及二联探针实时荧光定量PCR检测方法。     

犬冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的犬冠状病毒(CCoV)S基因的保守序列设计并合成1对特异性引物,建立了一种快速、灵敏和特异的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,用于CCoV的检测。特异性试验结果表明,该方法特异性强,与犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、副流感病毒和犬细小病毒等无交叉反应;敏感性试验结果表明,它的最低检测限为4×10~1~5×10~1 copies/L,高于常规RT-PCR方法 10倍左右;批内和批间重复试验的变异系数均小于1.20%。利用该方法和普通RT-PCR方法分别对76份临床样品进行检测;结果显示,普通RT-PCR的阳性率为69.7%,实时荧光定量RT-PCR的阳性率为78.9%。对于60份阳性病料,随机选择2份病料进行病毒分离,用阳性血清中和其他外源病毒后都出现了CPE,进行RT-PCR扩增后测序,结果证实为CCoV。以上结果表明,本研究建立的方法可以为犬冠状病毒病的快速诊断及流行病学调查提供技术手段。     

检测牛传染性鼻气管炎病毒和牛支原体的双重PCR方法的建立及应用

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是引起牛呼吸道疾病综合征(BRDC)的常见病原,临床上多见混合感染。本试验的目的是建立同时检测IBRV和M.bovis的双重PCR方法。通过设计引物、优化反应体系及条件,成功建立了同时检测IBRV和M.bovis的双重PCR方法。该方法具有良好的特异性和稳定性,且对IBRV和牛支原体的检测下限分别为2.03×104copies/L和1.65×104copies/L,灵敏度较好。利用该方法对四川省7个肉牛养殖场67份疑似BRDC样本进行检测,结果显示,IBRV和M.bovis阳性率分别为46.27%和32.84%,其中IBRV和M.bovis混合感染率为19.40%,表明四川省肉牛养殖场IBRV和M.bovis感染情况较普遍。     

猪非典型瘟病毒和盖塔病毒双重RT-PCR方法的建立与应用

为快速准确地检测出猪非典型瘟病毒(APPV)与盖塔病毒(GETV),根据GenBank中公布的APPV NS3基因和GETV NSP3基因序列,选择APPV NS3基因和GETV NSP3基因的保守序列,各设计并合成了1对特异性引物。通过优化反应体系和反应条件,最终建立可以同时扩增出500和810 bp特异性片段的双重RT-PCR。该方法对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒以及猪流行性腹泻病毒的扩增结果均为阴性。对APPV和GETV重组质粒的最低检出量分别为187和126 copies/μL并具有高重复性。应用本方法检测从四川自贡市、泸州市等地采集的38份仔猪肌肉震颤样本,结果显示,APPV、GETV的阳性率分别为13.16%和7.89%,与单一RT-PCR方法对APPV和GETV的检出率完全一致。本研究中成功建立的APPV、GETV双重RT-PCR方法为APPV和GETV的快速检测提供了技术手段,有助于仔猪先天性震颤的临床诊断和流行病学调查,对于公共卫生也有一定意义。