Cd~(2+)致线粒体损伤在rPT细胞凋亡中作用的研究

为探讨镉(Cd~(2+))致线粒体损伤在大鼠原代肾小管上皮细胞(r PT)凋亡中的作用,本研究对r PT细胞施以不同浓度梯度的Cd~(2+)经不同时间长短处理,并以添加PARP-1的抑制剂DPQ、抗氧化剂NAC处理作为对照处理,应用Western-blot的方法检测细胞中线粒体相关蛋白的表达,用免疫荧光的方法检测不同处理组中细胞凋亡率和线粒体膜电位的变化。结果显示,Cd~(2+)促进PARP-1蛋白的表达以及AIF和Cyt C从线粒体中释放;抑制PARP-1蛋白的活性后显著下调细胞凋亡率并且使线粒体膜电位恢复到相对正常水平;与Cd~(2+)组相比,Cd~(2+)+NAC处理组中相关促凋亡蛋白表达下降而抑凋亡蛋白表达增加,同时降低了细胞凋亡率,线粒体膜电位也恢复到相对正常水平。以上结果表明,Cd~(2+)使r PT细胞发生线粒体损伤以及氧化应激并且诱导细胞凋亡,其中PARP-1/AIF信号通路在这一过程中发挥了重要作用。     

人工感染PRRSV仔猪肺和子宫细胞凋亡的电镜观察

应用透射电子显微镜对仔猪感染猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)后不同时期肺和子宫凋亡细胞的超微形态结构进行了观察。结果表明,PRRSV可诱导宿主肺和子宫发生典型的细胞凋亡,表现为细胞的超微形态结构随着病毒感染进程出现不同的特征性变化,早期(感染后第8 h至第3 d)凋亡细胞多表现为细胞体积缩小,细胞质密度增强,染色质浓缩,核仁解体,内质网扩张;中期(感染后第5 d至第9 d)凋亡细胞体积显著缩小,细胞膜突起,线粒体增多,有凋亡小体形成;晚期(感染后第10 d以后)凋亡细胞形态多表现为凋亡小体降解和消失,少数凋亡细胞在凋亡晚期表现为坏死细胞。肺细胞凋亡主要发生于肺巨噬细胞和肺泡上皮细胞,子宫细胞凋亡主要发生于子宫内膜细胞和内膜腺细胞。     

白藜芦醇对玉米赤霉烯酮致TM4细胞氧化损伤及凋亡的保护作用

为探究白藜芦醇(RSV)对玉米赤霉烯酮(ZEA)致睾丸支持细胞氧化损伤及凋亡的保护作用,以小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞为研究对象,分别设对照组、ZEA组(20μmol/L)、RSV组(5μmol/L)、ZEA+RSV组(5μmol/L RSV处理30 min后+20μmol/L ZEA),24 h后,通过CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测ROS水平和细胞凋亡率,试剂盒检测细胞内MDA含量和SOD活力,免疫荧光法结合流式细胞术检测线粒体膜电位(ΔΨm)变化,Western-blot检测Fas/FasL通路相关蛋白表达。结果显示,与对照组相比,ZEA极显著抑制TM4细胞活性(P0.01),增加细胞凋亡率及提高ROS、SOD和MDA水平(P0.01),并能够显著增加Fas/FasL信号通路相关蛋白FasL、FADD、Cleaved-caspase8的表达水平(P0.05),极显著增加Fas的表达水平(P0.01);与ZEA组相比,ZEA+RSV组细胞活力显著提高(P0.05),细胞凋亡率和SOD水平显著降低(P0.05),ROS和MDA水平极显著下降(P0.01),Fas、FasL表达下调(P0.01和P0.05)。结果表明,RSV可有效减轻ZEA对小鼠睾丸支持细胞的氧化损伤作用,并能够通过调控Fas/FasL通路缓解ZEA诱导的睾丸支持细胞凋亡。     

铅镉联合对体外培养大鼠肾小管上皮细胞存活及凋亡的影响

采用机械筛网结合酶消化法建立了大鼠原代肾小管上皮细胞培养模型,在传代细胞增殖活性最强时间段进行铅、镉单独染毒或联合染毒.通过CCK-8还原法和流式细胞仪检测不同时间铅、镉对细胞存活率和凋亡率的影响.结果显示,铅、镉单独染毒高剂量组从第6 h开始、低剂量组从第12 h开始,其细胞存活率显著低于对照组(P＜0.05);铅、镉联合染毒组从第3 h开始,细胞存活率显著或极显著(P＜0.05或P＜0.01)低于对照组,且存活率的降低幅度与剂量呈正相关;染毒后第12 h,各组的凋亡率均极显著高于对照组(P＜0.01),铅、镉联合染毒组的细胞凋亡率显著高于各相关单独染毒组(P＜0.05),呈明显的剂量-效应关系.     

三聚氰胺对小白鼠内脏器官及其细胞凋亡的影响

为研究三聚氰胺急性中毒对小白鼠内脏器官的损害及对细胞凋亡的影响,将18～22g昆明种小白鼠40只随机分为4组,分别经口灌喂蒸馏水和不同剂量的三聚氰胺(370、739和1 479mg/kg)。染毒后第36小时处死小白鼠,观察肺等内脏器官的病理变化;用流式细胞术检测三聚氰胺对肺、肝、脾和肾组织细胞凋亡的影响。病理学观察显示,三聚氰胺各剂量组小白鼠肺充血,肺泡腔有少量红细胞和炎性细胞浸润。1 479、739mg/kg组小白鼠脾、肝轻度淤血,肾小管上皮细胞肿胀和蛋白管型。流式细胞仪检测结果显示,三聚氰胺各剂量组肾和肺的细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05),而各剂量组肝和脾的细胞凋亡率与对照组无显著差异(P>0.05)。证实,三聚氰胺急性中毒会造成小白鼠肾、肺、肝和脾损害并诱导肾和肺细胞的凋亡。     

猪瘟病毒感染猪外周血白细胞凋亡及CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的变化

为了解猪瘟病毒(CSFV)石门株强毒感染对免疫细胞的影响以及免疫细胞的变化动力学,用流式细胞仪对人工感染猪的白细胞凋亡以及CD4 和CD8 T淋巴细胞亚群的动态变化规律进行了检测.结果表明,攻毒后CD4 和CD8 T淋巴细胞比例急剧下降,CD4 T淋巴细胞比例在攻毒后第4 d和第7 d分别由攻毒前的26.87%下降到8.83%和13.86%,CD8 T淋巴细胞比例由攻毒前的28.17%分别下降到14.19%和17.55%.外周血白细胞凋亡的检测结果显示,发病初期感染组凋亡细胞和早期凋亡细胞均显著高于对照组,表明CSFV诱导细胞凋亡是导致免疫细胞减少和免疫抑制的主要原因.     

鼠巨噬细胞Ana-1培养弓形虫RH株速殖子的特性研究

为比较鼠巨噬细胞Ana-1(吞噬细胞)和Vero细胞(非吞噬细胞)培养弓形虫RH株后虫体以及虫体和宿主细胞间的表现,采用一般形态学观察、流式细胞术检测弓形虫接种后Ana-1细胞和Vero细胞的凋亡和坏死情况,并用NO检测试剂盒检测Ana-1细胞的NO分泌量.结果显示,弓形虫能够在两种细胞上大量发育和繁殖,而且两种细胞凋亡和坏死并存,Ana-1细胞以坏死为主(坏死率为58.6%,凋亡率为12.6%),Vero细胞则以凋亡为主(坏死率为28.7%,凋亡率为56.0%).对NO的检测显示,含100 mL/L小牛血清培养的Ana-1 NO分泌浓度为0.16～0.17 μmol/mL;而感染弓形虫速殖子的Ana-1 NO分泌浓度为0.18～0.46μmol/mL,两者差异显著(P＜0.05).证实,应用Ana-1和Vero细胞培养弓形虫均可获得大量虫体;弓形虫感染后吞噬细胞和非吞噬细胞的凋亡率和坏死率不同,差异极显著(P＜0.01);弓形虫感染能够诱导Ana-1分泌NO.     

线粒体损伤在阿维菌素致体外培养神经细胞凋亡中的作用

通过体外培养王鸽脑神经细胞,并按终浓度0、2.5、5和10μg/L阿维菌素(AVM)染毒,培养24 h时,经透射电镜观察神经细胞超微结构,DNA断裂评价细胞凋亡,MTT法测定线粒体活性,酶标仪检测Caspase-3、Caspase-9活性,流式细胞术测定线粒体跨膜电位(Δψm),探讨线粒体损伤在AVM致体外培养神经细胞凋亡中的作用。结果显示,AVM可明显抑制神经细胞线粒体的活性,引起Δψm下降,Caspase-3和Caspase-9活性升高,神经细胞发生凋亡,存在明显的剂量效应关系。证实,线粒体损伤是AVM致体外培养神经细胞凋亡的机理之一。     

猪链球菌2型对红细胞的黏附及溶血作用

为探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)感染过程中对血液红细胞(RBC)损害及其机理,本研究采取无特定病原微生物感染的猪血液制备RBC悬液,根据预试验选用SS2∶RBC感染比(MOI)为100的SS2,分别体外感染RBC 0.5、1、1.5、2 h,光镜下观察BRC的形态变化;用G iem sa染色、CF D A-SE荧光标记检测SS2对红细胞的黏附和损伤,流式细胞仪分析不同作用时间的黏附率,real-time PCR检测SS2相关黏附因子溶菌酶释放蛋白(MRP)、荚膜多糖(CPS)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、纤连蛋白和纤维蛋白结合蛋白(FBPS)及溶血因子溶血素(Sly)的转录水平。结果显示,SS2感染后第0.5~1小时,其主要黏附RBC,细胞呈现棘突样病变,少量细胞肿胀,出现轻微溶血,黏附率分别为18.7%和46.3%;感染后第1.5小时,SS2不仅可以黏附RBC,且多数细胞溶血,RBC开始发生破裂,黏附率可达到91.7%;感染后第2小时,细胞几乎全部破裂。MRP和CPS2J转录水平在感染后第0.5~1小时增高,并与黏附率呈正相关,感染后第2小时表达水平下降;Sly转录水平在感染后第0.5~2小时持续增加,与溶血现象呈正相关;GAPDH和FBPS在感染过程中变化不显著(P0.05)。结果表明,SS2感染早期可对RBC产生黏附和溶血作用,先为黏附作用,后为溶血作用,且作用过程较快;主要参与黏附因子为MRP和CPS2J,溶血因子为Sly;GAPDH和FBPS是否参与SS2对RBC的黏附与溶血仍需证实;本试验结果为研究SS2传播和致病机制提供了重要的理论依据。     

线粒体钙超载在镉致PC12细胞凋亡中的作用

为探讨线粒体钙超载在镉(Cd)致PC12细胞凋亡中的作用,用不同浓度Cd(0、2.5、5、10μmol/L)培养液分别处理PC12细胞12 h,或用5μmol/L Cd和15μmol/L钌红(MCU抑制剂,RR)共处理PC12细胞12 h。通过流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体钙离子水平变化,Western-blot检测Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达水平。结果表明,PC12细胞凋亡率和线粒体钙水平随着染Cd浓度增加显著或极显著增强(P0.05或P0.01);RR能显著抑制Cd暴露引起的PC12细胞Caspase-3蛋白活化并促进Bcl-2/Bax蛋白比值升高(P0.05),显著抑制Cd暴露引起的PC12细胞凋亡率上升(P0.05),说明线粒体钙超载参与到镉暴露引起的PC12细胞凋亡过程中并具有一定的调控作用。     

NAC在镉致PC12细胞凋亡线粒体途径中的保护效应

为研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)在镉致PC12细胞凋亡线粒体途径中的保护作用,本试验用10mol/L醋酸镉和100 mol/L NAC单独或联合处理PC12细胞24 h后,用MTT法检测细胞存活率;用流式细胞术检测细胞凋亡率;Western-blot法检测细胞色素C(cytochrome c,Cyt C)的释放以及Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved PARP蛋白的表达量。结果,NAC能显著或极显著抑制镉引起的细胞存活率下降,凋亡率上升,Cyt C从线粒体释放进入胞浆中,Bcl-2/Bax比值下降,Cleaved caspase-3和Cleaved PARP蛋白的表达量提高(P0.05或P0.01)。上述结果说明,NAC在镉致PC12细胞凋亡线粒体途径中具有保护作用。     

JA1对肝癌细胞端粒酶活性及细胞凋亡的影响

采用单管一步完成端粒重复序列扩增 (TRAP)法检测肝癌细胞 (HepG2 )经某豆科植物种子粗提物 (简称JA1)不同浓度作用前后和相同浓度、不同时间作用前后端粒酶活性的变化 ,并采用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的改变。结果显示 ,JA1可显著抑制HepG2的端粒酶活性 ,而且这种抑制效果有浓度依赖性和时间依赖性。流式细胞仪分析表明 ,经JA1作用后的HepG2标本中有明显的DNA低含量颗粒 (“亚G1期”峰 ) ,表明JA1诱导了HepG2的凋亡 ,且凋亡率与JA1的浓度和作用时间呈正相关。     

玉米赤霉烯酮对大鼠睾丸支持细胞Fas/FasL凋亡信号通路的影响

为探讨玉米赤霉烯酮(zearalenon,ZEA)诱导睾丸支持细胞(sertoli cell,SC)凋亡的影响,试验以分离大鼠原代SC为材料,不同浓度ZEA处理SC 24 h,采用CCK-8法观察支持细胞活力的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率的影响,q RT-PCR检测Fas、Fas L转录水平的变化,Western-blot法检测Fas、Fas L等凋亡相关蛋白表达的情况。结果显示,与对照组相比,随着ZEA浓度的升高,睾丸支持细胞的活力受到明显的抑制(P0.05或P0.01);流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,10、20 mol/L ZEA染毒组细胞凋亡率呈极显著升高(P0.01);q RT-PCR结果分析显示,10、20 mol/L染毒组细胞Fas和Fas L转录水平呈显著或极显著升高(P0.05或P0.01);凋亡相关蛋白检测结果显示,与对照组相比,5 mol/L以上ZEA染毒组Fas、Fas L、FADD、Cleaved-caspase8、Cleaved-caspase3蛋白表达均出现显著或极显著性升高(P0.05或P0.01)。结果表明,ZEA可以通过Fas/Fas L途径诱导睾丸支持细胞发生凋亡。     

口疮病毒ORFV125蛋白抑制宿主细胞凋亡的研究

分析显示,口疮病毒(ORFV)125蛋白的3D结构及其结构域与Bcl-2家族蛋白高度相似。为了探索ORFV125蛋白是否具有Bcl-2蛋白的抑制细胞凋亡作用,本研究通过构建ORFV125基因单个结构域突变体质粒BH1、BH2、BH3、BH4和缺失BH1、BH2、BH3、BH4结构域的突变体质粒,分别将不同质粒分别转染到293T细胞后培养24 h和72 h时通过流式细胞仪检测对细胞凋亡的作用。结果,在转染质粒的细胞培养到第24小时的细胞早期凋亡率低于5%,细胞晚期凋亡率低于6%;在转染质粒的细胞培养到第72小时的细胞早期凋亡率高于20%,细胞晚期凋亡率低于4%;而在同一时间点比较,各个的突变体之间的凋亡效果没有显著性差异。以上结果表明,ORFV125蛋白及其突变体具有抑制凋亡的作用,但随着凋亡时间的持续凋亡效果更加明显,这为进一步开展ORFV125蛋白的研究提供了实验基础。     

REV感染对SPF雏鸡免疫器官细胞凋亡及c-Myc基因表达的影响

为探究禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)感染对雏鸡胸腺、脾和法氏囊细胞凋亡及相关基因c-Myc表达、核质比值的影响,并阐述其相互关系。以1日龄SPF雏鸡为研究对象,应用分子生物学和免疫学技术结合病理学检测方法,通过对上述免疫器官c-Myc基因m RNA及其蛋白含量、c-Myc阳性细胞数、细胞凋亡率及核质比值的检测,较全面系统地研究了REV感染SPF雏鸡后第1、7、14、21、28和42天上述被检指标的动态变化。结果显示,REV感染雏鸡后,无论中枢免疫器官(胸腺、法氏囊)还是外周免疫器官(脾),其c-Myc基因mRNA表达和蛋白含量及阳性细胞数量均不同程度的高于对照雏鸡,其中21～28 d差异显著(P0.05)或极显著(P0.01);免疫器官细胞凋亡率在病毒感染后14～28 d极显著(P0.01)高于对照雏鸡;免疫器官细胞核质比值不同程度的小于对照雏鸡,特别是病毒感染后21～28 d差异显著(P0.05),以法氏囊细胞凋亡和核质比变化尤为明显;细胞凋亡率和核质比值变化具有较好的相关性(R~2=0.812,P0.01)。表明REV感染所致免疫器官细胞凋亡与c-Myc基因过表达密切相关,核质比值减小程度可间接反映细胞凋亡程度。     

猴头菇多糖对MDRV感染雏番鸭主要免疫器官细胞凋亡及血清免疫相关指标的影响

为探讨猴头菇多糖(HEP)对番鸭呼肠孤病毒(MDRV)感染番鸭主要免疫器官的细胞凋亡及免疫功能的影响,本研究将160只1日龄MDRV抗原、抗体阴性雏番鸭随机平均分为四组:空白对照组(NCG)、同居感染MDRV对照组(CICG)、HEP饮水对照组(HCG)和HEP饮水给药预防MDRV感染组(HPG)。四组试验雏番鸭分别于同居感染后第2、6、9、12天每组随机抽取5只鸭无菌采取肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊,将采集的样品制成病理组织切片,并用原位末端标记法(TUNEL法)观察并计算凋亡指数,以及用免疫组织化学染色法检测Fas-L蛋白;同居感染后第12天,每组抽取10只番鸭心脏无菌采血分离血清,测定总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、IgG、IgM、IgA和补体C3、C4。结果显示:HPG组在MDRV感染前期(感染后第2～6天)鸭肝脏、脾脏、胸腺和法氏囊器官的凋亡率极显著(P0.01)高于CICG组,而病毒感染后期(感染后第9～12天)则相反,同居感染后第12天血清各项检测指标值介于非病毒感染组与CICG组之间,其中T-AOC极显著(P0.01)高于CICG组,而MDA含量极显著(P0.01)低于CICG组,血清TP、ALB、GLO、IgA、IgM、IgG、C3、C4含量均显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于CICG组。结果表明,HEP饮水预防用药可促进MDRV感染早期雏番鸭肝脏和主要免疫器官细胞凋亡,抑制病毒感染中后期的细胞凋亡,减少组织器官损伤,维持较正常的抗氧化能力,提高血清蛋白、抗体及补体含量,有效缓解MDRV感染导致的免疫抑制。     

辛硫磷对大鼠肝细胞凋亡的影响

通过给大鼠肝细胞培养液中加入辛硫磷(染毒终浓度分别为3、10、30、100和300 μmol/L)染毒,于12、24 h后用流式细胞仪分别测定细胞凋亡率、细胞死亡率和细胞内活性氧(ROS)水平,并在扫描电镜和荧光显微镜下观察细胞凋亡情况,研究了辛硫磷对原代培养大鼠肝细胞凋亡的影响.结果显示,辛硫磷具有明显的细胞毒性,在3～100 μmol/L范围内随着染毒剂量的增大和染毒时间的延长,细胞死亡率、凋亡率和ROS水平显著升高,且发生了明显的细胞凋亡的形态学变化;但300 μmol/L辛硫磷培养24 h,肝细胞凋亡率和ROS水平下降,死亡率升高.表明辛硫磷对肝细胞有直接的毒性作用,并通过产生ROS诱导了肝细胞凋亡.     

H3N2亚型犬流感病毒与伪中间葡萄球菌的体外共感染研究

为了研究犬流感病毒(CIV)与伪中间葡萄球菌(Sp)对犬肾细胞(MDCK)的共感染作用,利用犬流感病毒、伪中间葡萄球菌和犬肾细胞,建立并优化了病毒-细菌体外细胞共感染模型。试验分4组:病毒单独感染组(CIV)、细菌单独感染组(Sp)、感染病毒后第12小时再感染细菌组(CIV/Sp)及空白对照组(C)。结果显示,病毒感染后第24小时,CIV/Sp组的细胞毒性为39.7%,极显著高于CIV组和Sp组(P0.001);CIV/Sp组病毒RNA载量显著低于CIV组(P0.001)。细菌黏附和侵袭试验表明,细菌感染后第4小时,CIV/Sp的黏附和侵袭量极显著高于Sp组(P0.001),侵袭量升高20倍。细菌感染后第6小时,CIV/Sp组IL-6、TNF-α的表达量均极显著高于其他3组(P0.001)。研究结果表明,犬流感病毒的预感染增强了伪中间葡萄球菌对体外培养细胞的继发感染。     

JA1对体外培养的Hep细胞和小鼠皮下移植性Hep细胞凋亡的影响

采用噻唑蓝(MTT)还原法、流式细胞术、光镜及透射电子显微镜技术等检测了梯度浓度的JA1(沙冬青提取物)对体外培养的小鼠肝癌细胞株Hep增殖的影响及诱导Hep细胞凋亡的作用;并检测了JA1对小鼠皮下移植性Hep细胞的生长抑制及诱导凋亡作用.结果显示,JA1可显著抑制小鼠Hep细胞的增殖,且这种抑制有浓度和时间依赖性.流式细胞仪分析显示,JA1处理后的Hep检测样本中有明显的DNA低含量颗粒("亚G1期"峰),细胞周期各时相分布发生了改变,细胞在G1期被阻滞.同时,JA1对小鼠皮下移植性Hep细胞也有明显的抑制作用.JA1灌胃试验组瘤组织细胞DNA直方图有明显的凋亡峰,细胞在G1期也被阻滞,光镜和电镜下可见大量凋亡肿瘤细胞.     

新城疫病毒通过巨胞饮作用入侵HeLa细胞的研究

新城疫病毒(NDV)在体外可以感染多种细胞,但是感染机制尚未完全明确。本试验针对NDV通过巨胞饮途径感染He La细胞的过程进行研究,选择特异性针对巨胞饮作用的药物抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)-阿米洛利(EIPA)、肌动蛋白(actin)聚合作用抑制剂细胞松弛素D(Cyto D)、PK C激酶抑制剂卡马拉素(Rottlerin)等,分别作用于He La细胞,通过W estern-blot和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测NDV感染He La细胞的情况。结果显示,在病毒感染后第3、6小时,EIPA能显著抑制NDV的进入,并且存在药物剂量的依赖性,同时,Cyto D和Rottlerin在第3、6和12小时也能显著抑制NDV的进入。结果表明,巨胞饮作用可能是NDV侵入细胞的一种重要途径,该结果将有助于进一步解析NDV的感染方式。