犬细小病毒SH14株的分离鉴定及其VP2基因的序列分析

为分离犬细小病毒(canine parvovirus,CPV),用疑似犬CPV感染的病犬肠组织研磨液接种猫肾细胞(CRFK),进行病毒分离,并利用常规病毒学和分子生物学方法以及动物回归试验鉴定分离的病毒,并对其VP2基因序列进行测定及分析。结果显示,该病毒能在CRFK细胞上良好生长并产生细胞变圆、脱落等特征性细胞病变;细胞培养物能扩增出CPV的特异性基因组;对病毒的VP2基因序列和推导的氨基酸序列进行分析,结果表明,本研究的分离毒株属于New CPV-2a型,与CPV SH-2/2011株的亲缘关系最近,其核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为99.83%和100%。上述结果表明,成功分离到1株New CPV-2a型犬细小病毒,将其暂命名为SH14株。本研究结果为进一步研究我国犬细小病毒的进化和变异,以及疫苗的研制奠定了物质基础。     

犬细小病毒JL-(18)1/Beagle株的分离鉴定及遗传进化分析

为研究犬细小病毒(CPV)流行株遗传变异情况,本研究从吉林省某比格犬养殖场采集疑似CPV感染致死犬的肠道组织,将病料接种至F81细胞进行病毒分离,并通过电镜形态学、PCR、血凝试验及动物回归试验进行鉴定。结果显示,所分离的这株病毒在F81细胞中产生了典型CPV细胞病变(CPE);在电镜下可见病毒呈无囊膜、直径为20 nm左右的病毒粒子;PCR鉴定证实CPV核酸呈阳性;血凝试验表明此病毒对猪红细胞具有凝集作用,血凝效价为1∶256;将这株病毒命名为JL-(18)1/Beagle。动物回归试验表明,JL-(18)1/Beagle使比格犬产生犬细小病毒感染的典型临床症状;以NS1基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与CPV-2c型分离株CPV-SH1516以及Canine/China/23/2017 NS1基因亲缘关系较近,而核苷酸相似率为100%;以VP2基因进行遗传进化分析显示,JL-(18)1/Beagle与New CPV-2b型CPV/CN/JL3/2013、CPV/CN/HB1/2013和CPV/CN/JL6/2013亲缘关系较近,核苷酸相似率为99.89%~99.94%;以VP2蛋白氨基酸进行序列分析表明,JL-(18)1/Beagle属于New CPV-2b型,与近期吉林CPV分离株相比,关键氨基酸位点无明显变化。因此,本试验从吉林省比格犬肠组织中分离到1株New CPV-2b型CPV毒株。     

犬细小病毒广西流行株的分离鉴定及生物学特性分析

为了解当前犬细小病毒广西地方毒株的生物学特性,本研究收集广西各地疑似犬细小病毒(CPV)感染病犬的粪便通过接种F81细胞进行病毒的分离培养,并通过血凝试验、抗性分析、同源性分析和攻毒试验等对分离毒株的生物学特性及致病力进行研究。结果显示,接种3代后,细胞出现明显的病变(CPE),血凝效价为1∶512,第5代病毒的TCID_(50)为1×10~(-3.6)/0.1 m L,能抗热、酸、氯仿和乙醚;电镜观察到CPV为直径约25 nm圆形、无囊膜的结构,应用CPV特异性引物检测到长约1 419 bp和1 254 bp的特异性条带,提示成功分离到一株犬细小病毒毒株;测序分析结果表明,VP2基因与周边国家地区及我国各地方的参考毒株、流行株核苷酸同源性为98.9%~99.8%;系统进化发生分析表明,广西分离株的基因型为CPV-2a亚型,与泰国参考毒株VT148亲缘关系最近;与其它CPV-2a亚型相比,分离株的第267位、305位、324位和440位氨基酸位点发生了变异;动物回归试验结果表明,犬细小病毒广西分离株属于强毒株。本研究成功分离到犬细小病毒广西地方流行株,并对其主要衣壳蛋白VP2基因进行遗传变异分析,为更好的预防和控制犬细小病毒提供依据。     

貉源细小病毒的分离鉴定

从大庆某貉养殖场采集病貉的病理病料,处理后接种于犬肾细胞(MDCK),分离到8株病毒.对分离毒株进行了中和试验、血凝试验、理化性质的鉴定试验,应用PCR方法扩增分离毒株VP2部分基因并进行序列分析.结果显示,病料接种MDCK细胞72 h后产生了明显的细胞病变(CPE);分离毒株可以被犬细小病毒阳性血清中和,中和效价为1:106～1:107;分离毒株对氯仿、乙醚不敏感,耐酸耐热,可以凝集猪红细胞,其凝集作用可被犬细小病毒阳性血清抑制;用PCR检测病毒的细胞培养液,可扩增出长531 bp的片段,该片段的核苷酸序列与吉林分离的犬细小病毒株(EU310373)的同源性为99.6%.表明,分离的这8株病毒均为貉源细小病毒.     

犬细小病毒2b亚型VP2基因的克隆及其B细胞抗原表位分析

对犬细小病毒2b亚型衣壳蛋白VP2基因进行了克隆、测序,并用分子生物学软件DNAStar对VP2基因的推导氨基酸序列进行了表位分析。结果显示,获得了犬细小病毒2b亚型的VP2基因,序列全长1 755 bp,编码584个氨基酸;B细胞表位主要位于VP2蛋白第1~38、73~83、86~104、152~195、235~243、294~326、347~400、404~416、469~483、503~521和571~585区段。表明,犬细小病毒2b亚型VP2蛋白上分布有多个B细胞抗原表位,这为犬细小病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猫细小病毒广西分离株FPV-GX01全基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西地区猫细小病毒(feline parvovirus,FPV)的生物学特性,阐明其基因组与遗传进化等特征。笔者采集经胶体金检测FPV阳性的粪便样品接种FK81细胞,进行病毒分离及理化特性鉴定,同时利用PCR分段扩增病毒基因组DNA,并与国内外分离株进行同源性及遗传进化比较分析。结果显示,分离株在FK81细胞上盲传3代后出现CPE,猪红细胞血凝价达1∶1 024,第5代病毒TCID50测定为10-5.2/0.1 m L,该毒株对热、酸、氯仿及乙醚有较强的抵抗力,将分离株命名为FPV-GX01。全基因测序结果表明,分离株基因组为4 901 bp,与2007年我国猫源细小病毒株FPV-XJ1同源性高达99.0%,属同一分支。氨基酸位点分析显示,FPV-GX01株VP2蛋白功能较少发生突变,与犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)氨基酸位点存在宿主差异;FPV-GX01 NS1蛋白序列上没有VP2蛋白稳定,第619位异亮氨酸突变成苯丙氨酸。广西地区分离的猫细小病毒也在不断发生遗传变异进化,本研究对该地区猫细小病毒的进化特征提供了一定的参考。     

犬细小病毒免疫球蛋白对犬细小病毒中和活性的研究报告

犬细小病毒免疫球蛋白是治疗该病的主要药物。本研究针对静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白、多克隆抗体进行了血凝抑制试验比较,并在细胞上对其进行了蛋白毒性试验和中和活性试验等对比研究。结果发现,免疫球蛋白和高免血清多克隆抗体的血凝抑制价分别为1×211和1×210,它们稀释16倍以后对细胞无毒性作用,其中静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白的中和抗体效价为1∶873,明显优于多克隆抗体的中和效价(1∶426)。以上研究结果为静脉注射用犬细小病毒免疫球蛋白对犬细小病毒病的治疗提供了细胞学上的依据。     

猫细小病毒广西株的分离鉴定及动物发病模型的建立

本研究通过利用FK81细胞按常规方法对猫细小病毒进行分离鉴定。选取其中效价最高的分离株以不同剂量经口腔和鼻腔感染猫,通过测定LD_(50),观察临床症状、白细胞含量变化、组织病理变化等指标,构建动物发病模型。从86份疑似猫瘟粪便样品中成功分离到6株猫细小病毒,其中GX01株TCID_(50)及血凝价均高于其他5株;不同剂量GX01感染猫后均表现出高热、腹泻、呕吐和体重下降等典型临床症状;感染后第3天粪便中检测到病毒;发病后期白细胞严重减少;攻毒第14天测定LD_(50)为1×10~(-2).2;解剖表现为肠臌气、部分脏器肿大有出血点;组织病理切片观察到十二指肠和肺上皮细胞出现胞浆、胞核侵染、坏死等明显的组织病变,肾出现脂肪变性。本研究成功分离6株广西地区猫细小病毒并建立发病动物模型,为猫细小病毒发病机制和治疗药物的研究奠定了基础。     

犬冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的犬冠状病毒(CCoV)S基因的保守序列设计并合成1对特异性引物,建立了一种快速、灵敏和特异的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,用于CCoV的检测。特异性试验结果表明,该方法特异性强,与犬瘟热病毒、犬腺病毒2型、副流感病毒和犬细小病毒等无交叉反应;敏感性试验结果表明,它的最低检测限为4×10~1~5×10~1 copies/L,高于常规RT-PCR方法 10倍左右;批内和批间重复试验的变异系数均小于1.20%。利用该方法和普通RT-PCR方法分别对76份临床样品进行检测;结果显示,普通RT-PCR的阳性率为69.7%,实时荧光定量RT-PCR的阳性率为78.9%。对于60份阳性病料,随机选择2份病料进行病毒分离,用阳性血清中和其他外源病毒后都出现了CPE,进行RT-PCR扩增后测序,结果证实为CCoV。以上结果表明,本研究建立的方法可以为犬冠状病毒病的快速诊断及流行病学调查提供技术手段。     

番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)基因组的非同源序列各设计了1对引物MDPVF1/R1和GPVF1/R1,建立了一种PCR方法,用该PCR方法分别对GPV、MDPV、鸭瘟病毒(DPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、犬细小病毒(CPV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)的病毒培养物及其核酸进行扩增。结果,引物MDPVF1/R1仅特异性扩增出MDPV的900 bp核酸片段,引物GPVF1/R1仅特异性扩增出GPV的465 bp核酸片段。表明,建立的PCR方法可用于GPV和MDPV的鉴别诊断。     

樱桃谷肉鸭源细小病毒QH-L01株的分离鉴定及VP1基因序列分析

2016年4月,四川邛崃某鸭场送检30只樱桃谷肉鸭,临床表现鸭喙变短、舌头伸出。从送检鸭脏器中分离鉴定出1株鸭源细小病毒,命名为QH-L01株。为进一步了解该病毒毒力及分子生物学特性,对其进行ELD50测定、VP1基因测序,并与其他细小病毒毒株进行比较。ELD50测定结果为10-6.54ELD50/0.2 m L;VP1核苷酸和氨基酸序列分析结果表明,该病毒结构基因全长2 203 bp,编码734个氨基酸,与鹅细小病毒核苷酸同源性为92.8%~99.8%,与番鸭细小病毒同源性为77.4%~87.3%;VP1编码的氨基酸同源性和鹅细小病毒及番鸭细小病毒分别为95.2%~99.5%和85.4%~91.1%。VP1基因进化分析显示,该病毒和鹅细小病毒SYG26-35分离株处于同一进化分支上。动物回归试验结果显示,试验组出现明显的鸭源细小病毒BADS症状,对照组无明显变化,表明该病毒分离鉴定成功。     

貉源犬腺病毒Ⅰ型的分离鉴定及生物学特性分析

用MDCK细胞从患病貉的临床样品中分离出1株病毒,并采用PCR、测序分析、免疫荧光试验、血凝试验和理化特性试验进行鉴定。结果显示:PCR扩增得到500 bp条带,其核苷酸序列与犬腺病毒Ⅰ型(CAV-1)同源性为93.2%～98.7%,而与CAV-2同源性仅为55.3%;接种该病毒的MDCK细胞出现了"葡萄串样"细胞病变(CPE),且胞核中有特异性亮绿色荧光;病毒滴度为1×107.4TCID50/m L;该病毒可以凝集人O型红细胞和豚鼠红细胞;对FUDR敏感,对乙醚、热、酸有一定的抵抗力。以上结果表明,本研究分离的病毒为貉源CAV-1。为了解CAV-1对貉的致病性和疫苗开发提供了依据。     

藏獒源犬细小病毒的分离鉴定

为弄清犬细小病毒(CPV)在藏獒中的流行情况,将临床上经胶体金试纸检测为阳性的藏獒直肠棉拭子8份处理后接种猫肾传代细胞(F81细胞),分离到6株病毒,对其进行了血凝试验(HA)、半数组织培养物感染剂量(TCID50)的测定,理化性质鉴定,提取分离株DNA并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其一特异性片段和VP2全序列,并与GenBank上登录的CPV毒株进行比对。结果表明,接毒后第6～13天在F81细胞上出现了明显的细胞病变(CPE),表现为细胞融合、变圆或拉长;所得分离株能使猪红细胞发生凝集反应,血凝效价为27～211;能抗酸(pH3)、热(60℃)、200mL/L乙醚、480mL/L氯仿;从细胞培养物中分别扩增出与特异性片段825bp一致以及与VP2全基因1 755bp一致的条带。将扩增的VP2序列与GenBank上登录的HQ883267.1、FJ222823.1、FJ005214.1等10个国内外CPV分离株的VP2序列进行比对;结果显示,与北京地区一分离株(HQ883267.1)的同源性最高,为99.0%～99.6%。所得分离株为不同毒株,但均为CPV-2a型。     

ICHV感染细胞的免疫胶体金扫描与透射电镜对比观察

本实验应用免疫胶体金扫描与透射电镜对犬传染性肝炎病毒(ICHV)感染的培养细胞进行对比观察,旨在为病毒—细胞间相互作用的研究提供一些形态学依据。 (一)材料与方法 1.病毒:系本所病毒室从犬传染性肝炎病犬的病料中分离并经鉴定的ICHV A-8301株的第5代细胞培养物。 2.细胞:为犬肾传代细胞,引自中国兽药监察所。 3.豚鼠抗ICHV lgG:自制,其血凝抑制试验滴度为1:64。 4.胶体金标记葡萄球菌A蛋白(SPA-G):购自军事医学科学院。透射电镜用金颗粒直径为10nm,扫描电镜用金颗粒直径为20nm。     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

北京地区犬冠状病毒的分离鉴定及遗传进化分析

采集北京地区宠物医院2～4周龄发生腹泻的幼犬粪便样品,经胶体金和PCR,将其初筛为犬冠状病毒(CCoV)阳性。然后,将其处理液接种于MDCK细胞和CRFK细胞,进行连续传代培养,出现特征性细胞病变。通过形态学观察、RT-PCR鉴定、间接免疫荧光试验,证明该分离株为犬冠状病毒,遂将其命名为CCoV BJ02株。针对M基因通过RT-PCR法鉴定分离株的基因型,证明其为CCoV-Ⅱ型。Reed-Muench法测得CCoV BJ02株的TCID_(50)为10~(–5.2)/100 L。通过绘制一步生长曲线发现,该病毒在48小时左右收毒效果最好。遗传进化分析表明,CCoV BJ02株与日本分离株CCoV fc1株位于同一分支中,同源性最高,有较近亲缘关系。上述研究结果为深入了解北京地区CCoV的流行情况,给犬冠状病毒病的诊断、防治及后续研究奠定了基础。     

用SPA-固相免疫电镜技术诊断犬细小病毒性肠炎

(一)材料与方法 1.被检粪样和肠内容物处理:新疆某警犬所出现呕吐、血样腹泻的病犬5只,采其粪样或病死犬肠内容物,分别编号为1、2、3、4、5号,按1/2(V/V)量加入0.01MpH7.6的PBS,充分振摇,冻融2次,再加入等量氯仿充分振荡后,3000rpm离心30分钟,吸取水相待检。 2.抗体:①西德产Magioban,该制品为含有犬瘟热、犬腺病毒肝炎、犬钩体、犬细小病毒的狗免疫球蛋白,批号为23795。②猫泛白细胞减少症阳性血清、南京农大蔡宝祥教授惠赠。     

湖南地区猪圆环病毒2型的分离与鉴定

为分离鉴定湖南地区2个猪场的猪圆环病毒2型(PCV2),从临床表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)猪体采集组织病料,验证为PCV2感染的病料,用无污染猪肾细胞系(PK15)细胞分离培养。采用间接免疫荧光试验(IFA)、分子克隆及生物信息学等方法对分离病毒进行分析。结果显示,分别获得了2株PCV2:1株为PCV2d(命名为ChenZ-2-1,GenBank号MH718995),另1株为PCV2b(命名为Yi Y-3-27,GenBank号KU317482),且两分离株的病毒效价TCID50分别为1×10~(5.66)/mL和1×10~(5.5)/mL。本研究有利于提高PCV2的诊断水平,对深入研究PCV2的发病机理及开发PCV2新型疫苗奠定基础。     

抗犬细小病毒单链抗体的制备

提取分泌犬细小病毒的杂交瘤细胞株3H9的总RNA,反转录获得c DNA链,并以此为模板扩增重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因,利用SOE PCR方法连接VH基因和VL基因,同时引入(Gly4Ser)3连接肽序列,扩增得到大小为765 bp的单链抗体(Sc Fv)基因。将Sc Fv基因连接至原核表达载体p ET-32a(+),构建成重组质粒p ET-32a-Sc Fv,转化至BL21(DE3)感受态细胞,并在37℃条件下进行IPTG诱导表达,得到融合蛋白。经SDS-PAGE分析大小约为46 ku,与预期结果相符。经Western-blotting鉴定,该蛋白能被抗His标签的单克隆抗体特异性识别。间接ELISA试验以及中和试验结果表明,Sc Fv能够与犬细小病毒结合,具有中和犬细小病毒的活性。本试验成功构建了抗犬细小病毒单链抗体,并获得了高效表达。     

CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用

参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒(CDV)N基因序列、犬细小病毒(CPV)VP2基因序列和犬冠状病毒(CCV)M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV(193 bp)、CDV(500 bp)和CCV(780bp)的多重纳米PCR(nano-mPCR)检测方法,同时考查所建立nano-mPCR检测方法的特异性和敏感性。结果表明,该方法特异性和敏感性良好,对CPV、CDV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10~2、6.0×10~2和6.7×10~2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。临床样品的检测结果表明,nano-mPCR的建立为CDV、CPV和CCV的单独或混合感染进行早期快速、灵敏、准确的鉴别诊断提供了新方法。