日本血吸虫冷冻童虫苗免疫绵羊试验

Taylor等(1976)的研究证明,用同种血吸虫辐照尾蚴或辐照童虫免疫接种绵羊,可使其对梅氏血吸虫(S.mat-theei)产生抵抗力。该作者等1979年用同种辐照童虫苗免疫接种绵羊,证明后者对牛血吸虫(S.bovis)也能产生抵抗力。Bick-le等(1979)应用同种和异种辐照致弱童虫免疫绵羊对抗梅氏血吸虫和牛血吸虫进一步作了试验观察。但直到1985年James等才首先应用冷冻辐照致弱童虫苗免疫接种绵羊预防牛血吸虫。关于绵羊日本血吸虫病方面,尚未见到有关免疫预防的报道。绵羊是日本血吸虫的易感动物之一。在我国人畜共患血吸虫病的传播方面,绵羊具有一定的重要性。为了应用日本血吸虫冷冻童虫苗进行家畜血吸     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt10a基因的克隆及其在童虫和成虫中mRNA表达量的变化

利用RACE技术从19日龄的日本血吸虫童虫中扩增了1个Wnt家族基因,并对其进行了生物信息学分析。同源性分析表明,该基因为日本血吸虫新基因,完整开放阅读框(ORF)长1896 bp,编码631个氨基酸,理论分子质量为73.3 ku。该基因编码的氨基酸序列具有Wnt家族蛋白的典型特征,与人、鼠Wnt10a的氨基酸序列同源性均为26%,推测为血吸虫的Wnt10a基因,命名为Sjwnt10a(Gen BanK登录号DQ643829)。利用实时荧光定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况,结果显示该基因在19日龄的日本血吸虫童虫中表达量最高,在14日龄童虫和44日龄雄虫中也有表达,但分别仅为19日龄童虫表达量的8.8%和5.0%,而在31日龄成虫和44日龄雌虫中没有检测到该基因。结果提示,童虫差异表达的Sjwnt10a基因可能对童虫的生长、发育至关重要。     

日本血吸虫童虫冷冻保藏方法的改进

研究日本血吸虫童虫保藏技术的目的是为了使经冷冻的童虫直接应用于免疫预防、免疫诊断、药物治疗的感染动物模型及虫种保存。自从James(1981)首先提出冷冻保存曼氏血吸虫以来,Stirewalt等(1984)、许绶泰等(1989,1990)相继进行冷冻保存血吸虫方法的研究。本文是在上述工作的基础上,对许绶泰等的冷冻保存童虫技术进行改进,以找出可以实际应用的方法。 (一)材料和方法 冷冻用日本血吸虫尾蚴由本所钉螺室提供,所用钉螺系湖北钉螺,血吸虫为日本血吸虫中国大陆株安徽贵池品系。冻存剂采用     

日本血吸虫保护性免疫机制的研究——体液免疫应答

本文应用辐照致弱日本血吸虫童虫疫苗、冷冻辐照致弱童虫苗和速冻致死童虫苗免疫雌性C_(57)BL/6小鼠,免疫后检测体液免疫应答动态变化。结果及相关分析表明抗膜抗体和依赖补体的抗体杀伤作用在抗血吸虫感染中起到一定作用,而抗可溶性抗原抗体和脾脏中B淋巴细胞百分数与保护力之间缺乏相关性。     

日本血吸虫童虫冷冻保藏方法试验

中、美合作研究结果业已证明,日本血吸虫辐照童虫苗对人工感染和现场试验免疫耕牛,都获得显著保护力。但这种活苗不能保存,不能运输。为了使日本血吸虫辐照童虫苗能作为重点地区、重点     

日本血吸虫童虫部分差异表达蛋白的质谱分析

应用蛋白质双向电泳技术和质谱技术对16日龄日本血吸虫童虫的可溶性蛋白进行分离、分析,得到了2 000±69个蛋白斑点,其中500±86个蛋白斑点与血吸虫雌虫和雄虫的蛋白所共有,童虫特异呈现的蛋白斑点有26±1个。对其中20个童虫特异呈现的蛋白斑点进行质谱和生物信息学分析的结果表明,它们代表了16种蛋白;对这些蛋白进行生物学功能预测的结果表明,它们可能与寄生虫的生物合成、能量代谢、信号传导和细胞构成等相关。     

联合法冷冻保存日本血吸虫童虫的研究

James(1981)首先提出了冷冻保存曼氏血吸虫的乙二醇二步加入速冻法,Stirewalt等(1984)认为该法很好,但培养大量童虫并加以冷冻却有困难,因此作了改良。我们采用该二氏的基本方法,结合本实验室条件,用乙二醇二步加速冻法保存日本血吸虫童虫的研究中,取得了解冻后形态正常并活动的童虫最多占44.68％的试验结果。在此基础上,进一步找出了本文报道的“联合法”。此法可以培养大量童虫,并可在冰冻状态下进行童虫的辐照。     

东方田鼠不同组织来源成纤维细胞的分离培养及比较

利用细胞体外培养技术,分别对东方田鼠胚胎、皮肤、肺、腹腔、肾及睾丸组织进行成纤维细胞的分离和传代培养,再与前期建立的两种东方田鼠永生化细胞系在传代次数、冻存复苏以及体外杀伤日本血吸虫童虫等相关生物学特性方面进行比较。结果显示,采用组织块贴壁法或胰蛋白酶消化法,可在体外进行东方田鼠不同组织来源成纤维细胞的培养、传代和冻存,光镜下细胞均贴壁生长,呈长梭形,为典型的成纤维样细胞;不同组织来源的成纤维细胞在最佳分离培养日龄、原代细胞贴壁时间、细胞纯度、传代次数及冻存后细胞活率等方面存在明显差异;与对照组相比,所有东方田鼠成纤维细胞培养上清均没有显著的体外杀伤日本血吸虫童虫的活性。结果表明,东方田鼠不同组织成纤维细胞的体外培养方法及生物学特性不同。     

MicroRNA-181a对日本血吸虫童虫抗原刺激巨噬细胞的免疫应答起负调节作用

用日本血吸虫童虫抗原SSA和miR-181a模拟物分别或共同刺激/转染RAW264.7巨噬细胞,再用实时定量PCR技术或流式细胞术分析细胞miR-181a和TNF-α等细胞因子及M1型和M2型巨噬细胞标记分子的表达变化。结果显示,日本血吸虫童虫抗原SSA刺激RAW264.7细胞后,miR-181a及IL-1β、IL-4、TNF-α、IL-10、IL-6等促炎因子上调表达,IL-13下调表达;miR-181a模拟物单独转染RAW264.7巨噬细胞后,细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α和M1型巨噬细胞标记分子INOS等下调表达,IL-4和M2型巨噬细胞标记分子arg-1上调表达。巨噬细胞先用SSA刺激后再转染miR-181a模拟物,IL-1β、IL-4、TNF-α、IL-10、IL-6等促炎因子都下调表达。流式细胞术分析结果显示,miR-181a对M1型标记物CD16/32的表达起到下调作用,对M2型标记分子CD206的表达起上调作用。本研究提示miR-181a对日本血吸虫SSA抗原刺激的巨噬细胞的免疫应答可能起负调节作用,并促进巨噬细胞向M2型细胞转化。     

水貂枸橼酸菌病诊断报告

1988年7、8月间,辽宁省某水貂养殖场发生了一起以腹泻为主要临床症状的传染病。有400余只水貂发病,其中100余只死亡。经临床检查、尸体剖检、细菌学检验及临床治疗,确诊为枸橼酸菌 (三)讨论 本试验结果冷冻辐照童虫免疫组绵羊的平均减虫率55.1％,差异显著(P<0.05),说明用钴60丙种射线10千拉德辐照的日本血吸虫童虫,经不同时间(从24h至50天)冷冻于液氮解冻复苏后作为疫苗是能够激发绵羊对同种血吸虫攻击感染的抵抗力的。绵羊是日本血吸虫宿主动物之一,是家畜血防工作的一种对象,这一初步结果是具有实际意义的。冻融死童虫作为疫苗是美国依阿华大学医学院李书颖教授等首先提出的,方法简单,不需辐照     

内蒙古土耳其斯坦东毕吸虫及其在终末宿主体内发育的研究

通过本试验证实土耳其斯坦东毕吸虫在终末宿主体内发育是:尾蚴侵入皮肤后至第5天皮肤内发现童虫,其中1.5～2.5天皮内童虫最多,并在2.5天开始向肺组织移行,至第6.5天肺组织内发现较多童虫,第8.5天肺组织内童虫数明显减少,并开始向肝脏的静脉管移行。在感染后第12.5天,肺组织内已找不到童虫,肝脏内可找到大量童虫。在感染后22.5天,大量童虫定居在肝脏的门静脉和肠系膜静脉内,同时发现部分配偶合抱的虫体。其结果表明:土耳其斯坦东毕吸虫的移行路线是由皮肤侵入后经静脉管入肺静脉后又随血循环进入肝脏,最终定居肝门静脉和肠系膜静脉,这与日本血吸虫的移行路线基本相同。     

日本血吸虫冷冻辐照童虫苗免疫程序的研究

应用日本血吸虫冷冻童虫苗于家畜的免疫程序的研究包括免疫次数、注射部位以及佐剂使用对免疫效果和现场应用的关系。为此,特在豚鼠进行试验。试验分9组进行,共用90只豚鼠。试验结果指出,冷冻辐照童虫苗可用来作皮内注射或肌肉注射。1次皮内注射加佐剂的减虫率达50.24％(P<0.001),仅略低于不冷冻的辐照童虫苗的减虫率(53.38％P<0.001),两者差异不显著。1次肌肉注射加佐剂的减虫率达40.62％(P<0.001)。但1次肌肉注射不加佐剂的减虫率亦达40.66％(P<0.001)。2次肌注的减虫率并不显著地高于1次肌注的。可见冷冻辐照童虫苗作皮内注射要加佐剂。作肌肉注射不必加佐剂,亦不必作2次免疫。     

用小鼠肠淋巴结淋巴细胞制备抗日本血吸虫单克隆抗体

应用感染血吸虫尾蚴11周的Balb/c小鼠肠淋巴结淋巴细胞建立16株血吸虫虫卵抗原特异性的单克隆抗体,选择其中的8株进行扩大培养并进行特性测定。双向琼脂扩散试验表明8株单抗都属IgG_1亚型。ELISA试验表明8株单抗都只对血吸虫虫卵抗原起反应,对肝片吸虫抗原和锥虫抗原都不起交叉反应。血吸虫雄虫和虫卵冰冻切片IFA试验表明8株单抗都定位于虫卵卵壳,其中1株同时定位于雄虫表膜,2株同时定位于雄虫肠壁。免疫电转移试验表明8株单抗都能识别血吸虫虫卵抗原55～98KD之间的多条抗原条带,其中有3株单抗同时识别雄虫抗原的1～2条抗原条带。ADCC试验表明在巨噬细胞或嗜酸性粒细胞介导下,8株单抗中有7株杀伤血吸虫童虫的效果比1:2稀释的、感染血吸虫尾蚴8周的Balb/c小鼠血清强。     

日本血吸虫保护性单克隆抗体SSj14识别模拟表位的筛选及其免疫原性分析

为分析日本血吸虫保护性单抗SSj14的模拟表位,观察其免疫保护作用,利用SSj14单抗筛选富集噬菌体的随机六肽库,应用免疫印迹法确定阳性克隆并分析其核苷酸序列,采用竞争ELISA法分析阳性克隆的抗原性,用筛选的阳性噬菌体克隆免疫小鼠进行日本血吸虫病免疫保护试验,计算减虫效果,并用ELISA法检测小鼠免疫前后的特异性抗体水平。结果显示,经3轮富集筛选后,免疫印迹法鉴定到4个阳性克隆,它们对SSj14单抗的抑制率分别为20.0%、40.8%、58.6%、61.5%,并分别在小鼠中诱导了7.42%、9.43%、11.74%、22.30%的减虫率。用噬菌体克隆免疫的小鼠均产生了较高水平的特异性抗体。结果表明,筛选到的阳性噬菌体克隆和SSj14单抗有较高的亲和力,并诱导了抗小鼠日本血吸虫的部分保护效果。     

日本血吸虫Sjzfp1基因的克隆表达及其表达产物的免疫效果

以PCR技术从日本血吸虫成虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆日本血吸虫锌指蛋白编码基因Sjzfp1以及181～786bp的DNA片段,分别以pGEX-4T和pET-28a(+)为表达载体制备重组抗原rSjzfp1/GST和rSjzfp1-1/His。将重组抗原与206佐剂混合后免疫小鼠,观察免疫预防效果。利用实时荧光定量PCR法检测Sjzfp1在不同发育期虫体中的表达情况。结果显示,获得了日本血吸虫Sjzfp1基因全长序列,其ORF为1017bp,编码338个氨基酸,推导的理论分子质量为38.5ku。生物信息学分析显示Sjzfp1为日本血吸虫环形锌指蛋白或PHD型锌指蛋白。以rSjzfp1/GST和rSjzfp1-1/His免疫小鼠,诱导的减虫率分别为50.43%和17.85%,肝虫卵减少率分别为72.64%和15.96%。实时荧光定量PCR分析表明Sjzfp1基因在各发育期虫体中均有表达,其中在尾蚴和毛蚴中表达量较高,在终末宿主体内各发育期虫体中,以42d成虫表达量最高。结果表明,Sjzfp1基因在抗血吸虫疫苗研究中具有进一步研究的潜力。     

基于细胞色素b氧化酶基因序列的中国大陆日本血吸虫虫株种系发育分析

为分析中国大陆日本血吸虫不同地理虫株线粒体细胞色素b(cytochrome b,cytb)氧化酶基因的遗传多态性并重构中国大陆日本血吸虫的种系发育关系,以cytb基因作为研究对象对中国大陆11个流行地区日本血吸虫虫株进行了扩增、测序.用Clustal X 1.81程序对序列进行比对,然后用Paup 4.0程序的MP法和NJ法及PUZZLE 4.1程序的ML法重构中国大陆日本血吸虫的种系发育关系;同时利用DNAS-tar 5.0中的Megalign程序进行相似性、碱基组成、转换、颠换分析.结果显示,对11个流行区的日本血吸虫PCR扩增后获得419 bp cytb部分序列,检测到7个变异位点,变异率为1.67%.种系发育关系分析发现,依据cytb基因可有效地区分我国日本血吸虫山区和湖区两种流行类型,显示种内遗传变异特点,并可将日本血吸虫与分体科的其他吸虫鉴别开来.因此,日本血吸虫cytb基因适合作为日本血吸虫分离株种系发育的遗传标记,也可以作为一种鉴别基因用于分体科吸虫的PCR鉴别诊断.     

《中国兽医科学》2007年(总第353~364期)索引

题名中文索引:·病原生物学·日本血吸虫童虫部分差异表达蛋白的质谱分析……………赵晓宇,姚利晓,孙安国,傅志强,刘金明,蔡幼民,林矫矫(1-1)猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响……………………………………………………………施开     

应用高剂量辐照童虫免疫接种耕牛预防日本血吸虫病

近年来,应用虫苗防制血吸虫病是令人感兴趣的研究课题。李书颖、徐锡藩于1969年首先提出的高剂量辐照童虫制成的致弱活苗,虽然其实际应用的可能性尚待研究,但看来是最有希望的虫苗。从1978年至1980年英国和苏丹的研究者在伦敦卫生和热带病学院的倡导下联合研究了应用辐照童虫免疫接种牛犊,使其抵抗牛血吸虫尾蚴感染的攻击,这项工作已在实验室和苏丹该病流行区自然感染的放牧区进行,减虫率和减卵率约为60％至70％,希望牛血吸虫病最终通过童虫苗的应用而在苏丹得到控制。     

日本血吸虫钙调神经磷酸酶B基因的克隆表达及表达产物的免疫保护效果的评估

为掌握日本血吸虫钙调神经磷酸酶B亚基(CNB)特性并评估其作为候选疫苗分子的潜力,采用PCR方法扩增日本血吸虫CNB基因,构建重组质粒pET-28a(+)-CNB,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用His-Bind亲和层析纯化获得重组蛋白rCNB。Western-blot结果显示,rCNB能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别,具有较好的免疫原性。免疫组织化学分析表明,CNB主要分布在日本血吸虫虫体的睾丸、卵巢等生殖器官中,在表膜中也有少量分布。用重组蛋白rCNB结合ISA206佐剂免疫BALB/c小鼠,结果 rCNB诱导小鼠产生了27.93%(P0.05)的减虫率和42.93%(P0.01)的肝减卵率。结果表明,日本血吸虫CNB具有一定的免疫保护效果,为深入研究日本血吸虫钙调神经磷酸酶的生物学功能奠定了基础。     

日本血吸虫抱雌沟蛋白DNA疫苗的研究

为构建含日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)完整ORF的核酸疫苗,评估该核酸疫苗在小鼠体内诱导抗血吸虫感染的免疫保护效果及其保护机制,将编码日本血吸虫大陆株抱雌沟蛋白基因ORF片段克隆到真核表达载体pVAX1中,用重组质粒pVAX1-SjGCP三次肌肉注射BALB/c小鼠,攻击感染血吸虫尾蚴,攻击感染后第42天剖杀小鼠冲虫,计算减虫率及肝和粪便的减卵率,评估其免疫保护效果。用流式细胞术(FCM)检测第3次免疫后小鼠淋巴细胞亚群CD4+、CD8+占总淋巴细胞的百分比及细胞因子IL-4、IFN-γ表达水平,探讨核酸疫苗的免疫机制。结果显示,小鼠经pVAX1-SjGCP质粒免疫后诱导了31.9%的减虫率,以及47.85%、68.04%的肝减卵率和粪便减卵率,与PBS组差异显著;pVAX1-SjGCP免疫组淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分比增加,细胞因子IFN-γ及特异性IgG水平提高,与pVAX1组差异显著。结果表明,血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗能够诱导宿主细胞免疫和体液免疫应答,产生Th1/Th2型混合的细胞免疫反应,具有一定的抗血吸虫感染的免疫保护效果。