坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR,针对坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,用PCR扩增E基因后将其连接到pMD19-T载体上构建重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板绘制了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,经反应条件优化后,绘制的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR的标准曲线的线性关系显著(r20.999),平均试验间变异系数为0.26%;检测敏感性可达到2×101 copies/μL。应用该方法对人工感染坦布苏病毒的鸭组织进行的检测结果显示,从36份病料组织中检出35份为阳性,检出率为97%。结果表明,成功建立了检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR,该方法较常规PCR更快捷、敏感、准确,适用于坦布苏病毒临床样品的检测。     

猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoV M基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10~8～6.57×10~1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10~1copies/μL;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。     

痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10~2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10~4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。     

鹅肾型星状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据鹅肾型星状病毒的ORF1b保守序列,设计出1对引物,建立了检测该病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的Ct值与标准质粒在2.42×10^4~2.42×10^9copies/μL范围内呈良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为24.2 copies/μL;该方法特异性强,对禽流感H9N2、鹅副黏病毒、鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于2.5%。运用该方法对动物回归试验中攻毒的雏鹅的各脏器进行检测,结果显示,肾、脾和肝中病毒含量较高,其次是胰腺、肺及肠道,而心和脑中的病毒含量最低。上述结果表明,本研究成功建立了鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并根据此方法检测出该病毒对肾、脾及肝具有较强的亲嗜性,为该病原致病机制研究奠定了基础。     

犬细小病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

参照GenBank中犬细小病毒(CPV)VP2基因保守区域序列设计合成特殊的内、外引物,在扩增反应体系中加入荧光染料SYBR GreenⅠ,通过恒温荧光检测仪Deaou-308C扩增检测,建立了一种快速检测CPV的实时荧光环介导等温扩增(LAMP)方法。结果显示,这种方法对CPV具有特异性的扩增反应,对照病毒核酸的扩增结果均为阴性。灵敏度试验最低可检出3.72 copies/μL的病毒核酸。重复性试验结果表明,其检测重复性良好。对30份临床宠物犬的粪便样品进行检测,与免疫胶体金检测试纸方法进行比较,符合率为90%。将本方法初步应用于大熊猫粪便中犬细小病毒的检测,结果表明,从大熊猫基地采集的84份粪便样品中有16份为细小病毒阳性,阳性率为19.0%。本方法在63℃下恒温45 min可以完成检测,操作简单、灵敏度高、特异性强,通过恒温实时荧光检测仪可实时检测及自动判读检测结果,对大熊猫的早期诊断非常重要。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。     

牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。     

山羊关节炎脑炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测山羊关节炎脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)的快速诊断方法,本研究根据CAEV甘肃株Gag基因设计1对引物,并以含有CAEV甘肃株全基因组序列的质粒pUC57-CAEV为模板,建立CAEV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.19×109~1.19×10^1 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997,斜率为-3.74,检测下限为1.19×10^1 copies/μL,且对痘苗病毒、山羊痘病毒均无扩增。重复性试验结果显示,批间与批内变异系数均小于1%,重复性好。本研究首次建立了CAEVGag基因的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法,为CAEV的快速检测和病毒感染预防提供了技术手段。     

牛新孢子虫病LAMP检测方法的建立

为建立一种快捷、灵敏的牛新孢子虫病检测方法,根据GenBank上登录的新孢子虫NcSAG1基因(AF132217)序列设计合成了2对环介导等温扩增(LAMP)特异引物,建立了检测牛新孢子虫病的LAMP技术,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验.结果显示,LAMP方法扩增牛新孢子虫的电泳产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光,酶切鉴定出现目的条带,LAMP方法检测的敏感性为5×10~5 copies/μL;特异性试验显示,新孢子虫检测管显色后呈阳性,而瑟氏泰勒虫、弓形虫和附红细胞体等对照组均呈阴性.表明,本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛新孢子虫病的检测.     

对虾白斑综合征病毒LAMP检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28的基因序列设计合成4条特异性引物,以pMDT-VP28重组质粒为标准模板,通过优化反应体系和反应条件,建立了WSSV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,测定LAMP对WSSV-DNA的最低检测限,并与巢式PCR进行了比较。结果显示,该LAMP方法的最佳反应温度为65℃,反应时间为60min;LAMP对WSSV的最低检测限为10copies/μL,而巢式PCR为100copies/μL,表明该LAMP方法的敏感性显著高于巢式PCR检测方法。因此,WSSV的LAMP检测方法比PCR更为简便、快速、灵敏,且无需昂贵的变温仪器,更适应水产养殖的现地检测,本研究为WSSV早期感染的快速检测提供了新方法。     

登革病毒SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法的建立及应用

为建立灵敏、高效的登革病毒检测方法,本试验拟以包含登革病毒3′端保守序列的质粒pUC57-DENV为模板,建立检测DENV的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在4.88×10~1～4.88×10~9copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.653。最低检测限度为4.88 copies/μL,对照组未出现特异性扩增,所有稀释度的标准品在80.20℃出现特异性熔解峰。组内和组间试验的变异系数均小于1%。本试验建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,可为登革病毒早期检测提供技术支持。     

猪捷申病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立一种快速且灵敏的猪捷申病毒(PTV)的检测方法,本研究根据登录于GenBank数据库的所有PTV毒株基因组序列信息,在其5'端非编码区的保守区域设计引物,经过一系列的试验测试和验证建立了能够广泛用于检测PTV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法。该方法特异性强,对除PTV外的其他常见猪病毒性病原的DNA或cDNA均无特异性的扩增。此外,该方法的敏感性高、重复性好,灵敏度能达到38.3 copiesμ/L,组内和组间变异系数均不超过2%。对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量RT-PCR方法的PTV检出率为68.18%,远高于普通RT-PCR的PTV检出率(22.73%)。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较。结果显示,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R~2=1,其扩增效率E=2.03,熔解曲线为尖锐单峰;不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,具有较强的特异性;最低检出浓度(1×10~1copies/μL)比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性和稳定性好;将36份临床样品检测结果进行比较,与普通RT-PCR的总符合率为88.89%。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏度高,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、特异、快速地检测食品中致病性沙门菌的方法,针对沙门菌致病性菌株特有的invA基因设计引物,PCR扩增目的片段,构建重组质粒pMD19-T-inv285,将其作为标准品进行real-time PCR反应体系的优化和标准曲线的绘制,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测;同时用该方法对90份肉品样品进行检测。结果显示,建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程为y=-3.397 1 x+27.313,相关系数r2=0.999 6。该方法的灵敏度为5×100copies/μL,是普通PCR(5×102 copies/μL)的100倍。对10种常见食源性细菌的检测结果均为阴性;组内和组间重复试验的变异系数均低于1%。对90份肉品样品的检出率(6/90,6.67%)显著高于快速MALDI-TOF-MS法和传统的细菌分离鉴定方法(均为3/90,3.33%)。结果表明,本试验建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于食品中致病性沙门菌的快速检测。     

Ⅰ群禽腺病毒环介导等温扩增检测方法的建立

根据Ⅰ群禽腺病毒Hexon基因保守区序列,设计了一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了一种适用于Ⅰ群禽腺病毒的LAMP快速检测方法。经检测,该方法的敏感性可达1×101copies/μL;对Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的检测结果均为阳性,而对产蛋下降综合征病毒(EDSV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽传染性法氏囊病病毒(IBDV)和禽传染性支气管炎病毒(IBV)的检测结果均为阴性;分别用建立的LAMP方法与常规PCR方法对24份临床疑似样品进行检测,结果检出阳性率分别为58.3%和37.5%。表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异性高,可用于Ⅰ群禽腺病毒感染的快速诊断。     

高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株.以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价.结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×109～3.15×100copies/uL具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.998;最低检测限为3.15 copies/uL.对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%.表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

小肠结肠炎耶尔森氏菌可视化LAMP检测方法的建立

通过优化LAMP反应体系中镁离子、甜菜碱、dNTP等反应组成成分,而后进行特异性试验,并优化钙黄绿素与氯化锰的比例放入LAMP体系内,最后应用LAMP检测含有小肠结肠炎耶尔森氏菌(耶氏菌)的肉品,从而建立一种能够检测耶氏菌并通过肉眼观察和判断试验结果的LAMP方法。结果显示,优化的25μL反应体系如下:9 mmol/L Mg~(2+)、1.8 mmol/L dNTPs、1.0 mol/L betaine、0.2μmol/L外引物、0.8μmol/L内引物、1μL Bst DNA polymerase (8 U/μL)、2.5μL 10×thermpol reaction buffer、228μmol/L钙黄绿素、324μmol/L氯化锰,反应温度65℃孵育60 min。LAMP检测耶氏菌基因组DNA的最低检测限是85.3×10~(-6)ng/μL,比文献PCR方法灵敏性高出2个数量级。LAMP方法对耶氏菌g DNA的最低检测限对应的基因拷贝数最低检测限是35,对应的CFU最低检测限是7×10~2CFU/m L。本试验建立的这种可视化的检测耶氏菌的LAMP方法,为耶氏菌的检测提供了一种新的参考。     

猪流行性腹泻病毒SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)株的ORF3基因序列保守型片段设计特异性引物,建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。在4.32×102～4.22×107copies范围内,它有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异峰,无引物二聚体,熔解温度为82.23℃±0.19℃。它对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,表明其特异性强。该方法的组内变异系数为0.05%～0.87%,组间变异系数为0.32%～1.24%,重复性好。结果表明,建立的SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR为PEDV早期感染的诊断及定量分析提供了新的方法。     

猪博卡病毒5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪博卡病毒5型NS1基因序列设计引物,建立了基于SYBR GreenⅠ的用以检测猪博卡病毒5型的实时荧光定量PCR。用该方法检测猪博卡病毒5型NS1基因,在3.64×102~3.64×107 copies/μL范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为(83.12±0.12)℃,对猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪输血传播病毒(TTV1和TTV2)的核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.35%~1.24%,组间变异系数为0.43%~1.46%。此方法的建立为定量分析猪博卡病毒5型感染猪的感染程度和靶器官提供了精确检测手段。