脂质体介导SV40T基因转染东方田鼠成纤维细胞的研究

采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的p SV3 neo质粒导入东方田鼠胚胎成纤维细胞和皮肤成纤维细胞,经过G418培养基加压筛选,定期观测每孔阳性克隆出现的时间、数量及生长状态;比较不同胎龄或日龄、细胞接种密度、传代次数、脂质体剂量对脂质体介导的SV40T基因转染东方田鼠胚胎和皮肤两种成纤维细胞效率的影响。结果显示,两种细胞的阳性克隆约在15 d后出现,随着胎龄或鼠龄的增加,阳性细胞克隆在数量和增殖程度上有减少和减慢的趋势;以接种密度为1×104/孔的胚胎和皮肤成纤维细胞转染和筛选效果最好,细胞克隆增殖最快,数量最多;随着传代次数的增加,细胞克隆转染和筛选效果变差;在其他条件一致的情况下,以1 L/孔脂质体使用剂量,阳性克隆出现的时间早、克隆数量多、生长状态好。     

日本血吸虫童虫冷冻保藏方法的改进

研究日本血吸虫童虫保藏技术的目的是为了使经冷冻的童虫直接应用于免疫预防、免疫诊断、药物治疗的感染动物模型及虫种保存。自从James(1981)首先提出冷冻保存曼氏血吸虫以来,Stirewalt等(1984)、许绶泰等(1989,1990)相继进行冷冻保存血吸虫方法的研究。本文是在上述工作的基础上,对许绶泰等的冷冻保存童虫技术进行改进,以找出可以实际应用的方法。 (一)材料和方法 冷冻用日本血吸虫尾蚴由本所钉螺室提供,所用钉螺系湖北钉螺,血吸虫为日本血吸虫中国大陆株安徽贵池品系。冻存剂采用     

日本血吸虫童虫部分差异表达蛋白的质谱分析

应用蛋白质双向电泳技术和质谱技术对16日龄日本血吸虫童虫的可溶性蛋白进行分离、分析,得到了2 000±69个蛋白斑点,其中500±86个蛋白斑点与血吸虫雌虫和雄虫的蛋白所共有,童虫特异呈现的蛋白斑点有26±1个。对其中20个童虫特异呈现的蛋白斑点进行质谱和生物信息学分析的结果表明,它们代表了16种蛋白;对这些蛋白进行生物学功能预测的结果表明,它们可能与寄生虫的生物合成、能量代谢、信号传导和细胞构成等相关。     

日本血吸虫14d童虫凋亡现象的观察

为观察BALB/c小鼠源日本血吸虫14d童虫的细胞凋亡现象,分别采用TUNEL检测法和透射电子显微镜从DNA分子水平和细胞层面上进行定性观察,并应用FITC-Annexin-V/PI双染色法通过流式细胞仪定量检测虫体凋亡细胞比例。结果表明,采用这3种方法均能在日本血吸虫14d童虫中观察到一定程度的细胞凋亡现象,但不会导致日本血吸虫该时期童虫的异常生长发育。     

日本血吸虫保护性免疫机制的研究——体液免疫应答

本文应用辐照致弱日本血吸虫童虫疫苗、冷冻辐照致弱童虫苗和速冻致死童虫苗免疫雌性C_(57)BL/6小鼠,免疫后检测体液免疫应答动态变化。结果及相关分析表明抗膜抗体和依赖补体的抗体杀伤作用在抗血吸虫感染中起到一定作用,而抗可溶性抗原抗体和脾脏中B淋巴细胞百分数与保护力之间缺乏相关性。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt10a基因的克隆及其在童虫和成虫中mRNA表达量的变化

利用RACE技术从19日龄的日本血吸虫童虫中扩增了1个Wnt家族基因,并对其进行了生物信息学分析。同源性分析表明,该基因为日本血吸虫新基因,完整开放阅读框(ORF)长1896 bp,编码631个氨基酸,理论分子质量为73.3 ku。该基因编码的氨基酸序列具有Wnt家族蛋白的典型特征,与人、鼠Wnt10a的氨基酸序列同源性均为26%,推测为血吸虫的Wnt10a基因,命名为Sjwnt10a(Gen BanK登录号DQ643829)。利用实时荧光定量PCR分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况,结果显示该基因在19日龄的日本血吸虫童虫中表达量最高,在14日龄童虫和44日龄雄虫中也有表达,但分别仅为19日龄童虫表达量的8.8%和5.0%,而在31日龄成虫和44日龄雌虫中没有检测到该基因。结果提示,童虫差异表达的Sjwnt10a基因可能对童虫的生长、发育至关重要。     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示,猪的卵丘细胞生长形成单层需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10~11 d和8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

联合法冷冻保存日本血吸虫童虫的研究

James(1981)首先提出了冷冻保存曼氏血吸虫的乙二醇二步加入速冻法,Stirewalt等(1984)认为该法很好,但培养大量童虫并加以冷冻却有困难,因此作了改良。我们采用该二氏的基本方法,结合本实验室条件,用乙二醇二步加速冻法保存日本血吸虫童虫的研究中,取得了解冻后形态正常并活动的童虫最多占44.68％的试验结果。在此基础上,进一步找出了本文报道的“联合法”。此法可以培养大量童虫,并可在冰冻状态下进行童虫的辐照。     

新生猪胰腺干细胞培养方法的建立

通过对不同饲养层和培养基以及细胞因子进行筛选,比较了各种培养基和细胞生长因子对细胞传代时间和增殖细胞比例的影响,选择最佳分离条件,建立了新生猪胰腺干细胞体外培养的最佳体系。结果显示,以成纤维细胞为饲养层,在含100 mL/L胎牛血清的L-DMEM中添加表皮生长因子、干细胞因子、白血病抑制因子的培养液中培养,细胞能快速增殖,多突起、多角形、小圆形、长梭形4种类型干细胞的增殖比例适中,而且各种类型的细胞都能长期传代培养。     

动物细胞的超低温长期保存效果观察

几年来我们应用-196℃的液氮超低温冻存技术,对牛睾丸、牛肾原代细胞,牛肾、猪睾丸、猪肾、狗肾、猫肾、地鼠肾、兔肾、非洲缘猴肾、小鼠纤维传代细胞等17种不同类型的细胞进行了长期冻存试验,并对其中8种细胞,进行了复苏培养观察,取得了满意的效果,细胞存活率达87％以上。     

山羊成骨细胞的体外培养和鉴定

采用初生山羊羔股骨骨膜,通过植块培养法、完全消化法和半消化植块法分离、培养成骨细胞。结果表明,植块培养法、完全消化法和半消化植块培养法的贴壁时间分别为4、24、4 h;培养4 d时的细胞数量分别为少量细胞、少量细胞、大量细胞,细胞汇合时间分别为21、19、10 d。传代后第7 d即可汇合,第14 d出现矿化结节,茜素红染色呈橘红色,Von Kossa染色呈黑色;姬姆萨和HE染色后可见体外培养的细胞呈三角形、多角形,胞质丰富,胞核卵圆形,单核,有1~3 个核仁;碱性磷酸酶染色后胞质呈黑色颗粒或块状沉淀;扫描电镜观察胞突发达,伸出的突起与临近细胞的突起相连。体外培养传至15代时细胞的生物学性状未发生变化。试验结果显示,半消化植块培养周期短,细胞损害小,有利于细胞贴壁,是一种可行的骨组织工程研究方法。     

内蒙古土耳其斯坦东毕吸虫及其在终末宿主体内发育的研究

通过本试验证实土耳其斯坦东毕吸虫在终末宿主体内发育是:尾蚴侵入皮肤后至第5天皮肤内发现童虫,其中1.5～2.5天皮内童虫最多,并在2.5天开始向肺组织移行,至第6.5天肺组织内发现较多童虫,第8.5天肺组织内童虫数明显减少,并开始向肝脏的静脉管移行。在感染后第12.5天,肺组织内已找不到童虫,肝脏内可找到大量童虫。在感染后22.5天,大量童虫定居在肝脏的门静脉和肠系膜静脉内,同时发现部分配偶合抱的虫体。其结果表明:土耳其斯坦东毕吸虫的移行路线是由皮肤侵入后经静脉管入肺静脉后又随血循环进入肝脏,最终定居肝门静脉和肠系膜静脉,这与日本血吸虫的移行路线基本相同。     

水貂枸橼酸菌病诊断报告

1988年7、8月间,辽宁省某水貂养殖场发生了一起以腹泻为主要临床症状的传染病。有400余只水貂发病,其中100余只死亡。经临床检查、尸体剖检、细菌学检验及临床治疗,确诊为枸橼酸菌 (三)讨论 本试验结果冷冻辐照童虫免疫组绵羊的平均减虫率55.1％,差异显著(P<0.05),说明用钴60丙种射线10千拉德辐照的日本血吸虫童虫,经不同时间(从24h至50天)冷冻于液氮解冻复苏后作为疫苗是能够激发绵羊对同种血吸虫攻击感染的抵抗力的。绵羊是日本血吸虫宿主动物之一,是家畜血防工作的一种对象,这一初步结果是具有实际意义的。冻融死童虫作为疫苗是美国依阿华大学医学院李书颖教授等首先提出的,方法简单,不需辐照     

牦牛胎儿成纤维细胞的分离培养

采用30d胚龄左右的牦牛胚胎,用2种不同的消化液消化后,将所得的牦牛胎儿成纤维细胞(yak embryonic fibroblasts,YEF)培养于不同血清含量的RPMI1640培养液中,并接种于2种不同材质的培养瓶表面,对YEF的分离方法、培养所需胎牛血清(FBS)添加量和不同基质表面对YEF生长的影响进行了研究。结果表明,含150 mL/L FBS的RPMI1640培养基最适合YEF生长,可传代27次以上;经用RPMI1640和D-Hank’s液配制的2．5 g／L胰蛋白酶消化,所得的YEF的细胞活率差异不显著(P>0．05),其原代细胞在含100 mL／L胎牛血清的RPMI1640培养液中的贴壁率差异极显著(P<0．01);不同生长基质对YEF的形态没有显著影响。     

寄生牛环形泰勒焦虫裂殖体的淋巴细胞冻存液的研究

牛环形泰勒焦虫裂殖体胶冻细胞苗,是我国血孢子虫免疫方面的第一个活虫苗,并已大面积应用于牛环形泰勒焦虫病流行区。我们于1977年试验成功了用液氮(-196℃)冻存含裂殖体牛淋巴细胞,为工厂化大量制苗提供了种子细胞,但种子细胞在液氮内冻存的过程中,也有程度不同的死亡,所以研究如何延长含裂殖体细胞苗的存活时间和提高种子细胞在掖氮中(-196℃)冻存后的存活率,是目前急待解决的问题。1985年我们曾用鱼鳞明胶和     

鸭疫里默氏杆菌培养滤液对鸭胚成纤维细胞形态的影响

为探索鸭疫里默氏杆菌的致病机制,研究了鸭疫里默氏杆菌培养滤液对鸭胚成纤维细胞形态的影响.结果显示,鸭疫里默氏杆菌AF株的培养滤液能使鸭胚成纤维细胞形态发生变化,表现为细胞膜和细胞质逐渐丢失、核浓缩等;90%(27/30)的鸭疫里默氏杆菌临床分离菌株能液化明胶,具有致病性,培养滤液具有改变鸭胚成纤维细胞形态的生物学活性;10%(3/30)的菌株不液化明胶,无致病性,培养滤液无改变鸭胚成纤维细胞形态的生物学活性;经硫酸铵盐析、阴离子交换、疏水和凝胶过滤层析,从AF株培养滤液中分离获得分子质量约为55 ku、能水解明胶及改变细胞形态的活性蛋白质.证实,降解明胶的蛋白水解酶是鸭疫里默氏杆菌培养滤液影响鸭胚成纤维细胞形态的活性物质,可能是细菌的毒力因子之一.     

用小鼠肠淋巴结淋巴细胞制备抗日本血吸虫单克隆抗体

应用感染血吸虫尾蚴11周的Balb/c小鼠肠淋巴结淋巴细胞建立16株血吸虫虫卵抗原特异性的单克隆抗体,选择其中的8株进行扩大培养并进行特性测定。双向琼脂扩散试验表明8株单抗都属IgG_1亚型。ELISA试验表明8株单抗都只对血吸虫虫卵抗原起反应,对肝片吸虫抗原和锥虫抗原都不起交叉反应。血吸虫雄虫和虫卵冰冻切片IFA试验表明8株单抗都定位于虫卵卵壳,其中1株同时定位于雄虫表膜,2株同时定位于雄虫肠壁。免疫电转移试验表明8株单抗都能识别血吸虫虫卵抗原55～98KD之间的多条抗原条带,其中有3株单抗同时识别雄虫抗原的1～2条抗原条带。ADCC试验表明在巨噬细胞或嗜酸性粒细胞介导下,8株单抗中有7株杀伤血吸虫童虫的效果比1:2稀释的、感染血吸虫尾蚴8周的Balb/c小鼠血清强。     

日本血吸虫冷冻辐照童虫苗免疫程序的研究

应用日本血吸虫冷冻童虫苗于家畜的免疫程序的研究包括免疫次数、注射部位以及佐剂使用对免疫效果和现场应用的关系。为此,特在豚鼠进行试验。试验分9组进行,共用90只豚鼠。试验结果指出,冷冻辐照童虫苗可用来作皮内注射或肌肉注射。1次皮内注射加佐剂的减虫率达50.24％(P<0.001),仅略低于不冷冻的辐照童虫苗的减虫率(53.38％P<0.001),两者差异不显著。1次肌肉注射加佐剂的减虫率达40.62％(P<0.001)。但1次肌肉注射不加佐剂的减虫率亦达40.66％(P<0.001)。2次肌注的减虫率并不显著地高于1次肌注的。可见冷冻辐照童虫苗作皮内注射要加佐剂。作肌肉注射不必加佐剂,亦不必作2次免疫。     

基于细胞色素b氧化酶基因序列的中国大陆日本血吸虫虫株种系发育分析

为分析中国大陆日本血吸虫不同地理虫株线粒体细胞色素b(cytochrome b,cytb)氧化酶基因的遗传多态性并重构中国大陆日本血吸虫的种系发育关系,以cytb基因作为研究对象对中国大陆11个流行地区日本血吸虫虫株进行了扩增、测序.用Clustal X 1.81程序对序列进行比对,然后用Paup 4.0程序的MP法和NJ法及PUZZLE 4.1程序的ML法重构中国大陆日本血吸虫的种系发育关系;同时利用DNAS-tar 5.0中的Megalign程序进行相似性、碱基组成、转换、颠换分析.结果显示,对11个流行区的日本血吸虫PCR扩增后获得419 bp cytb部分序列,检测到7个变异位点,变异率为1.67%.种系发育关系分析发现,依据cytb基因可有效地区分我国日本血吸虫山区和湖区两种流行类型,显示种内遗传变异特点,并可将日本血吸虫与分体科的其他吸虫鉴别开来.因此,日本血吸虫cytb基因适合作为日本血吸虫分离株种系发育的遗传标记,也可以作为一种鉴别基因用于分体科吸虫的PCR鉴别诊断.     

《中国兽医科学》2007年(总第353~364期)索引

题名中文索引:·病原生物学·日本血吸虫童虫部分差异表达蛋白的质谱分析……………赵晓宇,姚利晓,孙安国,傅志强,刘金明,蔡幼民,林矫矫(1-1)猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响……………………………………………………………施开