H3N8亚型马流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其生物学特性的研究

为了构建表达H3N8亚型马流感病毒HA蛋白的重组腺病毒,把A/Equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA基因克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,将重组穿梭质粒pShuttle-XJ3HA电转化至BJ5183感受态细胞中,与人5型腺病毒骨架质粒同源重组,获得了重组腺病毒质粒pAd-XJ3HA。该质粒线性化后转染AD293细胞,包装重组腺病毒rAd-XJ3HA。通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blot鉴定,证明HA基因已整合到腺病毒载体基因组中,并能够有效表达。该重组腺病毒在AD293细胞上连续传15代后仍表现出良好的遗传稳定性。马流感病毒HA基因重组腺病毒的成功构建为我国马流感重组病毒活载体疫苗的研究提供了技术储备。     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒(GPV)的检测抗原,利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VP1与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP(1-3),分别转染sf9细胞,得到重组病毒,分别表达出了54 ku的NS2融合蛋白和24 ku的VP(1-3)融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实,表达产物具有特异性;间接免疫荧光试验证实,重组蛋白在细胞中获得了表达。     

脑心肌炎病毒VP1基因重组腺病毒的构建及对小鼠免疫效果的研究

为构建脑心肌炎病毒(EM CV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体p Yr-adshuttle-4连接构建p Yr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得p Ad-VP1-EG FP重组腺病毒载体,将此载体于H EK 293细胞中包装最终成功获得r Ad-VP1-EGFP重组腺病毒,并测定其TCID50;构建的重组腺病毒感染细胞后在基因水平、蛋白水平对VP1进行检测;最后通过对小鼠免疫重组腺病毒后进行EMCV攻毒试验,验证其免疫效果。结果显示,成功构建了EMCV VP1基因重组腺病毒r Ad-VP1-EGFP,测得其TCID50为10-8.5/m L;感染细胞后基因水平及蛋白水平均可检测到VP1基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后的存活情况表明,重组腺病毒对小鼠有较好的免疫效果,且二次免疫后保护率显著高于单次免疫。结果表明,本试验成功制备了EMCV基因重组腺病毒,且对小鼠具有较好的免疫效果,可为进一步开发EMCV基因工程疫苗奠定基础。     

表达水泡性口炎病毒G蛋白的重组腺病毒的构建与鉴定

为了以复制缺陷型人5型腺病毒为表达载体,构建表达水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IN)G蛋白的重组腺病毒,利用PCR扩增编码VSV-IN G蛋白的基因,并将其克隆至腺病毒穿梭载体pacAd-CMV K-NpA中;再将含有目的基因的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体质粒用PacⅠ酶切线性化后共转染AAV-293细胞,获得重组腺病毒rAd-VSV-IN-G。该重组腺病毒于AAV-293细胞连续传代至第20代效价稳定。间接免疫荧光试验和Western-blot检测结果显示,G蛋白在重组腺病毒中可以被正确表达。上述研究成果为VSV重组腺病毒疫苗的研制奠定了基础。     

基于昆虫细胞表达的鹅细小病毒VP3蛋白的VP3-ELISA诊断方法的建立

将鹅细小病毒EP22株VP3基因克隆到杆状病毒转移载体pFast-Bac-HTB中,酶切鉴定及测序筛选出阳性重组转座载体pFastBac-VP3,转化至含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-VP3,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得到含鹅细小病毒VP3基因的重组杆状病毒rBV-VP3。经SDS-PAGE、Western-blot以及免疫组化试验证实,VP3基因在Sf9细胞中成功表达。利用表达的VP3蛋白建立VP3-ELISA血清学检测方法并对130份鹅血清样品进行检测,以中和试验作为金标准进行对比试验。结果显示,VP3-ELISA检测方法的特异性为100%,敏感性为96.2%,并且VP3-ELISA与其他鹅病阳性血清间不出现交叉反应性。上述研究结果表明,本研究建立的VP3-ELISA是一种特异的、灵敏的血清学诊断方法。     

鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒转移载体的构建

从含有鹅细小病毒 (GPV)H1株主要结构蛋白VP3基因的重组质粒pPROEXHTb VP3中切取GPVH 1株VP3基因片段 ,将其亚克隆于 pSY5 3 8的EcoRⅠ位点 ,并将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ报告基因平端克隆于上述重组子的SmaⅠ位点 ,再用NotⅠ切下同时含有VP3基因和LacZ报告基因的片段 ,亚克隆于pSY681的NotⅠ位点 ,构建了含有VP3基因的重组禽痘病毒转移载体。上述结果为GPV基因工程疫苗的研制奠定了基础     

犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及其真核表达

为构建犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒,并在真核细胞中表达,以重组质粒pVAX1-NcAMA1为模板,PCR扩增了NcAMA1基因,以此构建了pMD18T-NcAMA1重组克隆质粒;对该重组克隆质粒进行双酶切鉴定后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pCR259中。应用脂质体介导转染法将经PCR鉴定和酶切鉴定正确的pCR259-NcAMA1重组穿梭质粒转染293细胞,应用IFAT和Western-blot技术检测了AMA1基因在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的NcAMA1基因长度为1 695bp,构建的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1能在293细胞中获得瞬时表达,表达蛋白的分子质量约为68ku。     

鹅细小病毒野毒株VP3基因的原核表达及抗原性检测

根据发表的鹅细小病毒(GPV)基因序列设计合成了2对检测GPV的特异性引物,用其对疑似小鹅瘟的病料进行PCR检测,经序列比对后确定为GPV感染;利用引物Gs/Ga扩增获得的GPV野毒株VP3基因,测序后将VP3基因连接到原核表达载体pET-30a上,获得重组质粒pET-30a-VP3,将其转化感受态菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析.结果显示,重组菌可表达出分子质量约为66 000 u的重组融合蛋白,表达的蛋白以包涵体形式存在于菌体中.表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,获得了纯度较高的目的蛋白.Western-blot分析结果显示,纯化的蛋白能与GPV阳性血清发生特异性反应,证实表达的蛋白具有较好的抗原性.     

鹅细小病毒VP3基因疫苗两种不同免疫方式对细胞免疫的影响

将构建的鹅细小病毒(GPV)VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)转染鹅胚成纤维细胞(GEF),每隔12 h检测VP3蛋白的表达情况,同时以不同剂量分别通过基因枪轰击和肌肉注射免疫28日龄健康雏鹅,于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77和105 d采血,进行淋巴细胞增殖试验(MTT法)。结果,转染后第24 h即可在GEF中检测到GPV VP3蛋白,第60 h表达量达到高峰。试验组鹅外周血T淋巴细胞D490 nm值在免疫后第35 d达到最大。肌肉注射组和基因枪组免疫后第14~63 d、第7~63 d的D490 nm值分别与PBS对照组差异极显著;肌肉注射组及基因枪组免疫后第21~49 d的D490 nm值显著高于弱毒疫苗对照组;肌肉注射组及基因枪组免疫后第14~63 d的D490 nm值极显著高于空质粒对照组。表明,基因枪轰击和肌肉注射pcDNA-GPV-VP3均能诱导雏鹅产生良好的细胞免疫应答。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

猪脑心肌炎病毒P1和P12A3C基因重组腺病毒的构建及其在小鼠体内的免疫应答

为研制脑心肌炎病毒(EMCV)新型活载体疫苗,首先将病毒核衣壳前体多肽P1与P12A3C串联基因分别插入穿梭质粒pDC316中,构建得到了重组穿梭质粒pDC316-P1和pDC316-P12A3C。将其分别与辅助质粒pBHGloxΔE1、3Cre共转染293细胞,成功包装出重组腺病毒Ad-P1和Ad-P12A3C。免疫过氧化物酶单层试验确证,重组腺病毒可表达目的蛋白。分1次和2次肌肉注射免疫小鼠,然后通过间接ELISA试验和中和试验评价其诱导的特异性体液免疫水平。结果,Ad-P1诱导的VP1特异总抗体IgG水平显著高于Ad-P12A3C,但不能检测到明显的中和抗体(<1∶8);Ad-P12A3C能诱导产生良好的中和抗体(1∶32~1∶128),用1×108TCID50剂量EMCV BJC3株攻毒,Ad-P12A3C免疫组能获得100%的保护,而Ad-P1免疫组仅能获得部分保护。以上结果表明,Ad-P12A3C可作为良好的EMCV腺病毒活载体疫苗。     

脑心肌炎病毒衣壳蛋白VP3真核表达载体pCMV-HA-VP3的构建及融合表达

为构建脑心肌炎病毒(EMCV)衣壳蛋白VP3的真核表达载体pCMV-HA-VP3,以期实现其在HEK293、BHK21及HeLa这三种不同细胞中的表达。提取脑心肌炎病毒RNA,通过RT-PCR、酶切与连接等方法构建重组质粒pCMV-HA-VP3,将表达载体转染进HEK293、BHK21及HeLa这三种不同细胞中,利用RT-PCR进行基因表达情况检测,采用Western-blotting和IFA对融合蛋白在这三种不同细胞中的表达及定位情况进行分析。结果显示,成功构建了衣壳蛋白VP3的真核表达载体pCMV-HA-VP3,并且实现了VP3和HA标签在三种细胞中的融合表达,其在HEK293细胞中表达量最高,其次为BHK21细胞,表达量最低的是HeLa细胞。结果表明,表达的VP3蛋白具有抗原性,且在细胞膜、细胞浆和细胞核中均有分布,为深入研究衣壳蛋白VP3的功能及在EMCV感染过程中筛选与宿主细胞互作的蛋白夯实了基础。     

抗鹅细小病毒卵黄IgG的制备及其间接ELISA检测方法的建立

采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提与DEAE50纤维素层析相结合的方法从免疫鹅细小病毒(GPV)的鹅卵内提取鹅卵黄IgG,通过核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG的浓度和纯度后,制备兔抗鹅IgG酶标抗体;建立了针对GPV的间接ELISA抗体检测方法,确定其最佳工作条件,并对该ELISA的特异性及重复性进行检测;应用该间接ELISA检测了GPV VP3基因疫苗的免疫效果。结果显示,获得的纯化鹅卵黄IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度达到94.5%,兔抗鹅IgG的血清琼脂扩散效价约为1∶32;经筛选确定该ELISA的最佳工作条件为:最适抗原包被浓度为20μg/mL,最适血清稀释度为1∶100,酶标抗体的最佳工作浓度为1∶3 000。用建立的间接ELISA检测禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒的阳性血清均为阴性,表明该方法特异性强、重复性好。经临床初步应用,能检出GPV VP3基因疫苗产生的抗体,在肌肉注射100μg与200μg基因疫苗的鹅血清中,IgG均从第14天开始上升,并分别在第35、21天达到最大值。表明本试验制备的兔抗鹅IgG酶标抗体具有较好的应用价值。     

猪日本乙型脑炎病毒NS1基因重组腺病毒的构建及表达

应用RT-PCR方法扩增出猪日本乙型脑炎病毒(JEV)的NS1基因,通过SalⅠ EcoRⅠ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR鉴定及间接ELISA检测的结果证明所构建的重组腺病毒成功地表达了JEV的NS1。     

鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区的原核表达及其表达产物免疫原性的研究

为了构建鹅细小病毒亚单位疫苗候选菌株,通过软件优化分析预测鹅细小病毒结构蛋白VP3的抗原表位分布,并设计抗原表位富集区的引物,PCR扩增获得目的片段,双酶切定向连接于pET-30a表达载体,转化BL21表达菌株诱导表达,获得目的蛋白,使用该蛋白免疫SPF鸡,制备抗血清,使用鹅胚成纤维细胞原代细胞进行中和效价的测定。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a-VP3,通过条件优化蛋白以可溶性形式存在,免疫制备的抗血清中和效价能够达到-2.608。结论:本研究以可溶性形式成功表达了鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区,且该蛋白作为免疫原具有很好的产生中和抗体的能力。     

水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及多克隆抗体的制备

利用原核表达系统表达水貂肠炎细小病毒(MEV)VP2衣壳蛋白,以制备抗VP2超免疫血清。根据VP2的基因序列,设计1对特异性引物,以MEV全基因组重组质粒p B-MEV-L为模板,利用PCR技术扩增出MEV VP2片段,并定向克隆到pET-32a载体中,经酶切与序列测定,证明成功构建了VP2基因原核表达质粒pET-MEV-VP2。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后实现了高效表达。免疫印迹试验表明,获得的重组蛋白具有较好的反应原性。以该蛋白为免疫原免疫新西兰兔,制备抗血清,四免后用ELISA方法检测其效价达到1∶1 024。免疫荧光试验证明,获得的抗体具有良好的结合活性。为MEV的病原生物学研究奠定基础。     

猪肺炎支原体P97基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

采用PCR扩增了猪肺炎支原体(Mhp)R659株黏附因子P97基因,测定了其核苷酸序列,并将其克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA上。在脂质体介导下将PacⅠ酶线性化的重组穿梭质粒pacAd-P97和腺病毒骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染AD-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-P97,用RT-PCR、Westernblot和间接免疫荧光试验检测重组P97蛋白在AD-293和PK15细胞中的表达。之后,用Ad-P97抗血清检测Mhp对宿主细胞的黏附作用以及Ad-P97在仔猪体内的免疫应答反应。结果显示,P97基因由3 339个核苷酸组成,共编码1 113个氨基酸,其核苷酸序列高度保守;重组P97蛋白可在Ad-P97感染的AD-293细胞和PK15细胞中高效表达,但Ad-P97不能在PK15细胞中增殖并引起细胞病变;Ad-P97具有良好的免疫原性,能抑制Mhp对PK15细胞的黏附作用,诱导免疫仔猪产生Mhp凝集抗体。上述结果为进一步研制安全、高效的Mhp重组疫苗奠定了基础。     

蓝舌病毒VP6蛋白的原核表达及抗体制备

本试验首先利用RT-PCR技术扩增获得了蓝舌病毒1型(BTV1)的VP6基因,然后将其克隆到表达载体pPRoEx-HTb上,构建重组表达质粒pPro-VP6,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后用IPTG诱导表达,优化表达条件,纯化重组表达的VP6蛋白,免疫新西兰白兔制备抗VP6蛋白的多克隆抗体,利用Western-blot和细胞免疫荧光试验检测抗体的特异性及VP6蛋白在BTV1感染细胞中的分布。结果显示,重组VP6蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,利用组氨酸标签纯化树脂获得了高纯度的VP6蛋白;制备的抗VP6多克隆抗体不仅可与重组表达的VP6蛋白反应,而且可与BTV1感染细胞中的天然VP6蛋白发生特异性反应;在BTV1感染的BHK21细胞中检测到了VP6蛋白的特异表达,且分布于整个细胞质中。本研究成功表达了BTV重组VP6蛋白并制备了相应的特异抗体,为进一步揭示VP6蛋白的特性和功能奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒H基因或F基因重组山羊痘病毒活载体疫苗的研究

为构建能够表达小反刍兽疫病毒(PPRV)H基因或F基因的重组山羊痘病毒(GPV)并以此为活载体疫苗,在通用转移质粒pTKfpgigp的多克隆位点中插入PPRV的H基因或F基因,构建重组转移质粒pTKfpgigp-PPRV H和pTKfpgigp-PPRV F,并用Lipofectamine 2000转染已感染GPV的原代绵羊睾丸细胞,经同源重组产生重组GPV(rGPV)。用GFP和gpt选择标记筛选纯化rGPV,通过RT-PCR和免疫荧光技术检测rGPV在原代绵羊睾丸细胞中外源基因的表达情况。将获得的rGPV皮内接种山羊,检测抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体的变化情况。结果显示,获得了含有PPRV H基因或F基因的病毒株rGPV-PPRV H和rGPV-PPRV F;在原代绵羊睾丸细胞中rGPV所含的外源基因进行了正常转录和翻译,表达产物能与PPRV抗血清产生特异性反应,动物免疫试验表明,2株rGPV能诱导产生高水平的抗山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒的特异性抗体。上述研究结果为PPRV重组标记疫苗的研制提供了参考。     

A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒的构建及其免疫效力的研究

为构建A型塞内卡病毒(SVA)P12A-3C基因的真核表达质粒,提取SVACH-FJ-2017株的RNA,经RT-PCR方法扩增得到衣壳前体蛋白P12A基因和蛋白酶3C基因,利用融合PCR方法获得P12A-3C基因并将其构建到真核表达质粒pc DNA~(TM)3.1/myc-His(-)上,获得表达质粒pCD-P12A-3C,用脂质体Lipofectamine~(TM)2000将该质粒转染293T细胞后,进行间接免疫荧光(IFA)检测;且用Myc单抗和SVA VP1单抗进行Western-blot分析;大量提取并纯化表达质粒,免疫小鼠后用间接ELISA法检测抗体水平变化情况。结果,SVA真核表达质粒pCD-P12A-3C经酶切及测序鉴定证明构建正确,转染293T细胞后IFA可见明显的绿色荧光,表明P12A-3C基因可在细胞内表达;将转染细胞裂解后进行Western-blot分析,结果显示该质粒可表达3C蛋白,且表达产物可与SVA VP1单抗发生特异性反应;免疫小鼠后抗体检测结果表明,二免后第14天,免疫小鼠抗体水平比对照组明显增高;该结果表明本研究构建的真核表达质粒pCD-P12A-3C可正确表达相应蛋白,且所表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。结论:本研究成功构建了A型塞内卡病毒P12A-3C基因真核表达质粒并进行了免疫效力初步验证,为A型塞内卡核酸疫苗的研制奠定了基础。