小反刍兽疫病毒F基因核酸疫苗的构建及免疫原性

为了寻求一种有效的疫苗用于预防小反刍兽疫(PPR),运用RT-PCR方法扩增PPRV的F基因并将其克隆到pCAGGS载体中,构建了真核表达质粒pCAGGS-F。将构建的重组质粒转染哺乳动物细胞上进行瞬时表达,通过Western-blotting、间接免疫荧光检测证实F蛋白得到了高效表达。将重组质粒作为DNA疫苗,通过脚掌皮内注射免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测抗体的产生情况。结果显示,pCAGGS-F重组质粒在有无佐剂CpG的情况下均能诱导小鼠产生较高的抗体水平。     

小反刍兽疫病毒F和H蛋白在CHO细胞中的融合表达及其免疫原性的研究

以小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)疫苗株Nigeria75/1基因序列为基础,构建了融合表达PPRV囊膜蛋白F和H胞外区的真核重组质粒pcDNA3.1-F-H,在悬浮CHO细胞中进行分泌表达。离心收集转染后的细胞培养上清进行亲和层析纯化,纯化样品经Western-blot鉴定,融合蛋白与PPRV阳性血清和His标签抗体都能发生免疫反应。使用纯化后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导小鼠体内产生针对PPRV的特异性抗体。上述研究结果为小反刍兽疫新型亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒H基因过表达对病毒增殖的影响

为研究小反刍兽疫病毒H基因过表达后对病毒增殖的影响,根据G en Bank中小反刍兽疫病毒疫苗株Nigeria 75/1 H基因序列,设计1对引物扩增H基因全长编码区序列,并将其连接至真核表达载体p EGF P-C 3上,经鉴定正确后转染CHS-20细胞,并通过R T-PCR、荧光观察及W estern-blot分别在m RNA和蛋白水平检测H基因的表达。结果表明,H基因在CHS-20细胞内得到了表达。将p EGFP-C3-PPRV H重组质粒、空载体p EGFP-C3转染CHS-20细胞,待H基因表达后,接种PPRV Nigeria 75/1,病毒增殖一定时间后,以β-actin作为内参基因,采用相对荧光定量RT-PCR法研究病毒增殖量的变化。结果表明,相对于未转染及转染空载体p EGFP-C3的细胞,转染p EGFP-C3-PPRV H重组质粒的细胞PPRV增殖量得到了提高,且差异显著(P0.05),这说明在CHS-20细胞中过表达PPRV H基因能促进PPRV增殖。     

小反刍兽疫病毒H基因胞外区的表达与分析

为了掌握小反刍兽疫病毒(PPRV)H蛋白胞外区的功能,根据GenBank中已发表的小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株的H基因序列设计相应引物,分别克隆tH基因后构建原核表达载体pET-30a(+)-tH和真核表达载体pPIC9K-tH。将测序正确的重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)和酵母菌GS115,而后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,tH蛋白均获得了高效表达,融合蛋白的分子质量约为60ku,原核表达产物以包涵体的形式存在,其表达产量为4.68g/L,而目的蛋白的真核表达产量为0.5~1g/L。Western-blot分析表明,所表达的重组蛋白能被抗PPRV Nigeria 75/1株的阳性家兔血清特异性识别。结果表明,成功表达了小反刍兽疫病毒H基因胞外区,重组表达蛋白具有良好的反应原性,这为PPRV H蛋白与其受体相互作用功能区的确定奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒H糖蛋白基因原核表达载体的构建及表达

参照GenBank中小反刍兽疫病毒(PPRV)H抗原基因序列,人工合成了PPRV H基因,将其克隆至pUC18-T质粒中,转化E.coliJM109感受态细胞,构建并选择PPRV H基因克隆重组质粒,经核苷酸序列分析正确,将其克隆至pBAD/Thio-TOPO载体中,转化E.coliTOP10感受态细胞,核苷酸序列分析证实,成功构建了PPRV H基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导,可稳定、高效地表达PPRV H抗原。SDS-PAGE分析结果表明,用终浓度为0.2 g/L的L-阿拉伯糖诱导5 h的表达量最高,表达蛋白为分子质量约83 ku的融合蛋白;经薄层扫描分析,其表达产量约占菌体总蛋白的10%。Western-blotting检测表明,诱导的蛋白能与PPRV H蛋白单抗发生特异性反应,说明表达的融合蛋白中含有PPRV H糖蛋白抗原。     

小反刍兽疫病毒N蛋白单克隆抗体的制备及其阻断化学发光抗体检测方法的建立

为了快速高效地检测小反刍兽疫病毒(PPRV),本研究旨在建立并优化小反刍兽疫N蛋白阻断化学发光抗体检测方法。原核表达并纯化了小反刍兽疫病毒N蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,研制出PPRV N蛋白的特异性单克隆细胞5F2B10。用纯化的N蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体5F2B10作为阻断抗体,优化反应条件后,确定N蛋白最佳稀释浓度为0.25μg/mL,阻断抗体的最佳稀释浓度为0.5μg/mL,待测血清按1∶8稀释后37℃反应1 h,底物最佳条件为室温避光5 min。通过检测40份小反刍兽疫病毒阳性血清和40份阴性血清,最终确定阴阳性样品抑制率(PI)临界值为50%。特异性试验证明该方法与山羊痘病毒(GPV)、羊口疮病毒(ORFV)、口蹄疫病毒(FMDV)的阳性血清不发生交叉反应。通过对220份绵羊血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒的符合率为94.5%(208/220)。上述结果表明,建立的阻断化学发光抗体检测方法可用于PPRV临床样品的抗体水平检测,为PPRV疫苗免疫效果检验及PPRV根除提供了新的方法。     

小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆与原核表达

提取小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1的总RNA,用RT-PCR方法扩增F基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒为模板克隆去掉N端信号肽和跨膜区的F基因(F-1)并亚克隆于原核表达载体pET-30a(+),得到重组质粒pET30-F-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫SPF家兔制备抗体,进行间接免疫荧光检测并用ELISA测定抗体效价.结果显示,目的基因正确插入了表达载体,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,用重组蛋白免疫3次后,兔血清抗体达到较高水平,Western-blot分析说明表达产物能够与兔血清抗体发生特异性反应,间接免疫荧光试验显示重组蛋白免疫兔阳性血清能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.表明,重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达,并且具有较好的反应原性.     

表达鹅细小病毒VP3基因的重组腺病毒的构建及其免疫原性分析

为构建表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因的重组腺病毒,并检测其对雏鹅的免疫效果,将GPV VP3基因克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒,构建了重组穿梭质粒pacAd-VP3;将经PacⅠ酶切线性化的重组穿梭质粒与骨架质粒共转染HEK293AD细胞,得到重组腺病毒rAd-VP3。采用RT-PCR、Western-blot和间接免疫荧光试验鉴定GPV VP3基因在真核细胞中的表达,用rAd-VP3免疫1月龄雏鹅,检测血清抗GPV蛋白抗体水平。结果显示,重组腺病毒rAd-VP3能感染HEK293AD和GEF细胞并表达GPV VP3蛋白,增殖至第6代重组病毒的效价可达108.23 TCID50/0.1mL;rAd-VP3能诱导雏鹅产生抗GPV特异抗体,免疫后第28天血清中抗GPV VP3蛋白抗体仍维持较高水平。结果表明,rAd-VP3具有良好的免疫原性,可作为一种安全有效的病毒活载体疫苗用于鹅细小病毒病的免疫预防。     

小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种能快速、特异、敏感地检测血清中小反刍兽疫病毒(PPRV)抗体的方法,通过RT-PCR方法扩增出1 830bp的小反刍兽疫病毒的H基因,并将其克隆至原核表达载体pET-22b(+)中,进行H基因的重组表达。采用SDS-PAGE和Western-blot对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。用纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。通过矩阵法优化抗原最佳包被浓度、血清稀释度、最佳封闭剂、酶标二抗的最佳稀释度及孵育时间。结果显示,重组H蛋白(分子质量为68ku)能与PPRV阳性血清发生特异性反应。用建立的间接ELISA与标准竞争ELISA试剂盒检测92份临床样品并进行比较,两者的符合率为94.11%。结果表明,本研究建立的间接ELISA可以用于临床PPRV抗体的检测。     

小反刍兽疫病毒H和F蛋白多抗原表位的表达及其反应原性

将通过计算机软件预测并通过间接ELISA检测确定的小反刍兽疫病毒(PPRV)H、F蛋白的10个B细胞抗原表位串联,再加上一个外源通用T细胞表位,表位之间用甘氨酸间隔,人工合成一条多抗原表位编码基因序列,将其插入原核表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)诱导表达。结果获得分子质量为19 ku的表达蛋白,该蛋白可与PPRV感染阳性血清发生特异性免疫反应。结果表明人工合成的PPRV多抗原表位编码基因可以在原核表达系统中表达,表达产物具有反应原性,这为研究PPRV抗原表位疫苗奠定了基础。     

绵羊睾丸支持细胞的分离鉴定及其在山羊痘病毒疫苗株培养中的应用

为研究绵羊睾丸支持细胞对山羊痘病毒的增殖特性,采用胶原酶Ⅳ和胰酶两步法分离绵羊睾丸支持细胞,通过倒置显微镜进行形态学观察、细胞染色鉴定以及特异性表达ABP蛋白鉴定,然后接种山羊痘病毒疫苗株。结果显示,分离的原代细胞24 h可长满单层,用0.05%的胰酶消化处理3次可得到纯度约为80%的睾丸支持细胞;油红O染色可观察到绵羊睾丸支持细胞的细胞质含有大量脂肪滴,细胞核可见双极小体;HE染色后细胞核为蓝色,细胞质呈红色或粉红色。ABP蛋白间接免疫荧光可观察到在绵羊睾丸支持细胞的细胞质和细胞核周围有绿色荧光,经显微镜下计数其纯度达80%以上。接种山羊痘病毒疫苗株后第4天有90%细胞产生病变,细胞变圆,细胞聚集成簇状,细胞收缩、细胞核出现空泡化。qPCR扩增Ct值为18.81,Ct值低于其他细胞传代数值。结论,本研究成功分离培养了绵羊睾丸支持细胞,该细胞能较好地培养山羊痘病毒疫苗株,对羊痘疫苗的生产有一定的现实意义。     

小反刍兽疫病毒样颗粒装配的研究

为了探究小反刍兽疫病毒(PPRV)是否能够装配成病毒样颗粒(VLPs),选取PPRV的4个结构蛋白(基质蛋白M、核蛋白N、血凝素蛋白H和融合蛋白F)基因,分别构建其真核表达载体,利用间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况,并在Vero细胞上进行共表达,电镜下观察VLPs的装配情况。结果显示,构建的4个真核表达载体在Vero细胞上均得到了高效表达;共表达的4种蛋白在Vero细胞上成功装配并释放了PPRV VLPs,其形态和大小与PPRV Nigeria 75/1株感染细胞后观察到的病毒粒子的形态和大小一致。经免疫电镜检测,装配形成的VLPs能够识别特异性抗体。结果表明,本试验成功装配并释放了PPRV VLPs,为后续研制高效、安全的PPR新型疫苗奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒F基因真核载体的构建与表达

根据GenBank中小反刍兽疫病毒(Nigeria 75/I株)F基因序列设计了引物,应用RT-PCR方法获得了目的基因,纯化回收后将其连接到克隆载体pMD18-T上.将鉴定与序列测定后的目的基因再克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,经过鉴定,成功构建了含有小反刍兽疫病毒F基因的真核细胞表达栽体pEGFP-N1-F.利用脂质体介导阳性pEGFP-N1-F质粒转染了BHK-21细胞.Western-blotting证实,表达的pEGFP-N1-F融合蛋白(90 ku)具有免疫活性.     

小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。     

山羊痘病毒P32基因与绵羊CD58基因共表达载体的构建及其免疫活性分析

为了增强山羊痘病毒P32蛋白的免疫效果,发挥CD58的免疫佐剂作用,将山羊痘病毒P32基因和绵羊CD58基因构建在同一载体上,转染BHK21细胞,通过直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验分别间接检测P32和直接检测CD58在BHK21中的表达。结果显示,P32和CD58在BHK21细胞中都有表达。以构建的P32基因与绵羊CD58基因共表达载体为DNA疫苗,通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,定期采血,用ELISA检测免疫抗体水平,用MTT法检测细胞免疫情况;结果表明,共表达载体可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。     

山羊痘病毒感染绵羊的诊断及其p32基因的分子分析

采用细胞培养方法从发生羊痘的绵羊肺组织中分离到1株山羊痘病毒GPV/GSgulang/09,对分离株的p32基因进行了PCR-RFLP和序列比对分析.结果显示,GPV/GSgulang/09株p32基因的扩增产物被Hinf I酶切后出现山羊痘病毒(GPV)特征性的2条带;p32基因序列第166～168位缺失绵羊痘病毒(...     

小反刍兽疫病毒N蛋白主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了建立可特异性地检测血清中抗小反刍兽疫病毒(PRRV)抗体的方法,对具有小反刍兽疫病毒特异性的N蛋白第Ⅳ区域进行扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,用于小反刍兽疫病毒N亚单位重组蛋白的表达。用纯化的重组蛋白作为检测抗原,建立了检测血清中抗小反刍兽疫病毒抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA的抗原包被量、血清稀释倍数、血清孵育时间等反应条件进行了优化。Western-blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的反应原性。所建立的间接ELISA方法可以鉴别血清中的小反刍兽疫病毒抗体和牛瘟病毒抗体,具有良好的特异性和灵敏性,与标准竞争ELISA试剂盒的符合率达98.4%。证实,本研究建立的检测血清中抗PPRV抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性和灵敏性。     

小反刍兽疫病毒受体细胞系的构建及应用

为建立一株稳定表达山羊淋巴细胞活化分子(signaling lym phocyte activation molecule,SLA M)的细胞系,给研究小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)感染机制、病毒的分离和疫苗生产等奠定基础,本研究采用PCR扩增了SLAM基因,并将其胞外区连接至pD isplay载体,构建了重组质粒pDisplayg SLAM;利用p Display载体的G 418抗性及抗SLAM单克隆抗体,筛选表达gSLAM的Vero-E6细胞系,对该细胞系进行PCR鉴定、间接免疫荧光试验和Western-blot鉴定。采用该细胞系分离PPRV,并与Vero-E6细胞同时吸附PPRV分离株和疫苗株病毒后进行比较。结果,成功筛选出表达g SLAM的Vero-E6细胞系gSLAM/Vero-E6,并通过PCR方法成功扩增出gSLAM基因。通过间接免疫荧光试验和Western-blot鉴定,gSLAM基因成功表达在细胞膜上,并分离出一株PPRV。gSLAM/Vero-E6细胞系和Vero-E6细胞同时吸附PPRV分离株和疫苗株后,gSLAM/Vero-E6细胞系较Vero-E6细胞产生更明显的细胞病变。上述研究结果表明,gSLAM/Vero-E6细胞系对PPRV是高度敏感,为PPRV的后续研究提供了试验材料。     

抗小反刍兽疫病毒P蛋白单链抗体的制备及鉴定

为制备抗小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1株P蛋白的单克隆抗体并获得其单链抗体(ScFv)基因,利用纯化的PPRV和带有GST标签的重组P蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗PPRV P蛋白的单克隆抗体(m Ab),从分泌抗PPRV P单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,扩增VH基因和VL基因,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法获得单链抗体全长基因,并克隆至原核表达载体p ET32a(+)中,再将构建的重组质粒p ET32a-ScFv-3A6转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导单链抗体重组蛋白表达。结果,获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株3A6、1P4、3F8和1P1,对m Ab 3A6进行了Western-blot鉴定和间接免疫荧光试验(IFA)。成功扩增了杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,获得了ScFv-3A6重组蛋白,大小为47 ku,证实该重组蛋白具有较强的抗原结合活性。上述研究结果表明,本研究获得了4株能稳定分泌抗PPRV P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,并成功扩增到杂交瘤细胞株3A6的ScFv基因,实现了原核表达,为PPR防控新措施的研究奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒样颗粒的构建及定量分析

为研制一种无生物传染性且极易保存稳定的小反刍兽疫病毒(PPRV)RNA阳性质控品,以pTrcHis-MS2质粒为模板,借助点突变技术在噬菌体MS2编码的外壳蛋白第15位与第16位氨基酸基因之间插入组氨酸蛋白标签的相应序列,构建了pTrcMS载体。将pGEM-T-N382质粒与pTrcMS质粒分别进行KpnⅠ+HindⅢ双酶切、连接从而构建了pTrcMS-PPRV重组质粒。将pTrcMS-PPRV重组菌进行原核表达,借助偶联组氨酸蛋白标签的磁珠捕获技术获得纯化的小反刍兽疫病毒样颗粒,对它进行特性鉴定并定量检测。结果显示,pTrcMS-PPRV病毒样物质纯度高;电镜下为不规则的、直径约为26nm的多边形;耐RNA酶A,稳定;经荧光RT-PCR定量检测,此病毒样物质的溶液浓度相当于108.56 PFU/mL。本研究将为小反刍兽疫病毒分子生物学的检测提供阳性质控物质。