牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白D位点单克隆抗体的制备和鉴定

通过大肠杆菌表达了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的D位点,并以D位点的六聚体作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法进行克隆。结果显示,得到3株能稳定分泌抗TGEV S蛋白D位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2C104、5E1012和4B101,其中2C104和5E1012分泌抗体类型是IgM亚类,4B101为IgG1亚类。2C104、5E1012、4B101三株杂交瘤细胞培养上清液的间接ELISA抗体效价分别为1∶128、1∶128、1∶64,腹水效价分别为1∶103、1∶104、1∶4×103。间接免疫荧光鉴定结果表明,3株细胞均能和TGEV发生特异性反应,且在连续传代和冻存后仍能稳定分泌抗体。本研究针对S蛋白D位点制备了单克隆抗体,为传染性胃肠炎的诊断和TGEV与宿主互作机制的研究奠定了基础。     

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用大肠杆菌表达系统表达获得了伪狂犬病病毒(PRV)超强毒株ZJ01的gB和gE重组蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆和间接ELISA筛选,获得了4株能稳定分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞培养上清的ELISA抗体效价在1∶1 600~1∶6 400之间,腹水抗体效价达1∶4×105;连续培养20代,抗体效价基本一致。抗gB单克隆抗体B1B6和B3D7属于IgG2b,抗gE单克隆抗体E1B11和E5C10属于IgG1,轻链均为κ型。Western-blot和IFA结果显示,4株单克隆抗体均能与PRV流行毒株ZJ01、HZ、SD、NJ、LA发生特异性反应,B1B6和B3D7还能与PRV gE基因缺失疫苗毒株Bartha-K61发生反应,但E1B11和E5C10不能与Bartha-K61发生反应。     

鸭疫里默氏杆菌表面抗原D15截短蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗鸭疫里默氏杆菌(RA)tD15蛋白的单克隆抗体并对其特性进行鉴定,应用纯化复性的重组tD15蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,应用有限稀释法筛选出抗RA tD15重组蛋白的阳性杂交瘤细胞株;采用腹水诱生法制备单克隆抗体腹水,用饱和硫酸铵法纯化腹水抗体;采用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞以及测定单克隆抗体的特性、效价及其相对亲和力。结果显示,获得2株抗RA tD15蛋白的阳性杂交瘤细胞株,遂被命名为4#、16#,2株细胞株经反复冻存复苏,体外传代仍能稳定分泌抗体;4#单克隆抗体属于IgG1,κ链;16#单克隆抗体属于IgG2b,κ链;4#杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶3 200,腹水效价为1∶12 800,16#杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶6 400,腹水效价为1∶204 800;2株单克隆抗体均能够识别大小约为34ku的蛋白,说明这2株单克隆抗体是特异性识别tD15蛋白的抗体;这2株单克隆抗体能够与鸭疫里默氏杆菌全菌裂解蛋白发生特异性反应,而不与其他鸭源的病原体发生反应;测得它们的亲和常数分别为1.52×109 L/mol和1.00×1010 L/mol。结果表明,这2株单克隆抗体可能识别两种不同的抗原表位。     

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及其鉴定

将沙丁胺醇 (salbutamol)琥珀酰化后 ,应用混合酸酐法与牛血清白蛋白偶联 ,免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术获得了 1株能稳定分泌抗沙丁胺醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该单抗为IgG1亚类。经间接ELISA方法测定 ,其细胞上清抗体效价为 1∶3 .2× 10 6,腹水抗体效价为 1∶6.4× 10 8。该抗体与克仑特罗交叉反应率为 5 0 .0 0 % ,与莱克多巴胺交叉反应率为 0 .3 0 %。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。     

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。     

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。     

猪IFN-α1重组蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其生物学特性

应用杂交瘤细胞技术,将用猪IFN-α1重组蛋白免疫的小鼠脾细胞经与骨髓瘤细胞融合、筛选和多次克隆化培养,成功获得了3株能稳定分泌抗猪IFN-α1的单克隆杂交瘤细胞株,分别将其命名为4E9、5B2和5H11。这3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经ELISA检测,体外细胞培养上清的效价均可达到1∶104,体内腹水的效价均可达1∶105;SDS-PAGE分析显示,纯化的这3株单克隆抗体的重链分子质量均在60ku以上,轻链均在30ku以上,符合抗体IgG重链、轻链分子的大小;抗体亚类鉴定表明4E9、5B2为IgG2a类,5H11株为IgG2b类,且其抗原结合位点基本一致。细胞染色体分析表明,3株杂交瘤细胞株染色体平均数为88～96条,远高于骨髓瘤细胞或脾细胞的染色体数,从遗传角度证实获得了杂交瘤细胞株;在杂交瘤细胞的稳定性试验中,这3株细胞经多次冻存复苏和传代培养,不同代次细胞上清中的抗体效价均在1∶104～1∶105之间,说明该3株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的性能稳定。     

克伦特罗单克隆抗体的制备与鉴定

将克伦特罗(Clenbuterol)重氮化后与牛血清白蛋白偶联,免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术获得1株稳定分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该单克隆抗体为IgG1亚类,用间接ELISA测定细胞上清液抗体效价为11.6×106,腹水抗体效价为13.2×108.抗体与沙丁胺醇无交叉反应.该细胞株体外传代培养和冻存复苏后仍能稳定分泌抗体.     

猪传染性胃肠炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,按照常规方法融合、筛选,最终获得2株抗TGEV N蛋白的杂交瘤细胞系,分别命名为2G7和2C2。2株单抗亚类均为Ig G1,腹水的间接ELISA效价均为1∶108。2株杂交瘤细胞连续培养20代,各代次的上清效价保持不变,均为1∶12 800,说明2株细胞分泌抗体的能力稳定。通过间接免疫荧光发现,制备的2株单克隆抗体能与感染TGEV的细胞发生特异性反应,在胞浆和细胞膜上有亮绿色荧光。结果表明,所制备的2株TGEV N蛋白的特异性单克隆抗体细胞株遗传稳定,分泌的抗体敏感性高,为TGEV病原检测奠定了基础。     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

阿维菌素单克隆抗体的制备与鉴定

将与牛血清白蛋白(BSA)偶联的阿维菌素人工合成抗原AVM-BSA免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了2株分泌抗阿维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F2和2H10。生物学特性鉴定的结果表明,2株杂交瘤细胞株诱生腹水的效价为1∶6 400,分泌的抗体亚型均为IgM;间接竞争酶联免疫吸附试验结果表明,抗体的50%抑制质量浓度(IC50)为101 ng/mL,2株单克隆抗体与伊维菌素、多拉菌素、红霉素和白霉素均无交叉反应,证实单克隆抗体2H10具有很强的特异性,可用于阿维菌素药物残留免疫分析方法的建立。     

抗山羊IgMμ链单克隆抗体的制备及鉴定

将构建的山羊IgMμ链的原核表达重组质粒pET30a-IgMμ转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达获得重组蛋白His-IgMμ;以Ni-NTA亲和层析法纯化His-IgMμ重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、抗体筛选和细胞克隆等杂交瘤细胞技术,筛选能稳定分泌抗山羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用小鼠腹腔诱生腹水的方法制备出抗IgMμ链单抗,并鉴定单抗的生物学特性。结果,成功构建了重组表达载体pET30a-IgMμ,诱导表达、纯化得到了目的蛋白;获得了4株能稳定分泌抗山羊IgMμ链单克隆抗体的杂交瘤细胞株,4株单抗腹水的效价均达到了1×10~(-4)以上,其中1D8、5D1和6G10株单抗亚型为IgG1,9H8株的亚型为IgG 2a,轻链均为κ;1D8、5D1、6G10和9H8的亲和力平衡解离常数KD分别为1.87×10~(-11)、8.46×10~(-7)、4.26×10~(-9)和4.07×10~(-10);经Western-blot鉴定,单克隆抗体6G10能特异性识别原核表达的HisIgMμ蛋白。上述研究结果表明,本研究获得了4株高亲和力和效价的抗山羊IgMμ链特异性单克隆抗体,这为山羊感染性疾病的早期诊断、预报预警和防控提供了基础条件。     

牛支原体脂蛋白P48单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛支原体表面脂蛋白P48的单克隆抗体,应用纯化的牛支原体武威株脂蛋白P48基因的原核表达产物免疫BALB/c小鼠,继而取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经克隆和筛选,获得2株能分泌抗牛支原体脂蛋白P48抗体的杂交瘤细胞融合株,并分别命名为C7及E5。ELISA和W estern-blot检测结果表明,2株单克隆抗体均可与牛支原体特异性地结合,而与牛的其他常见病原菌无任何反应。亚类鉴定结果表明,2株单克隆抗体重链均为Ig G 1,轻链均为λ型。稳定性试验结果表明,2株杂交瘤细胞均可稳定分泌单克隆抗体。本研究结果为建立牛支原体有效的检测方法和深入研究脂蛋白P48的生物学功能奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

将合成的非洲猪瘟病毒K205R基因序列插入p ET-28a(+)表达载体,经IPTG诱导表达p ET-28aK205R重组蛋白。用制备的重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用化学融合方法融合、筛选,获得了6A4、7F5和7G3三株抗K205R蛋白的杂交瘤细胞株。经鉴定,这3株单克隆抗体(单抗)的亚类均为Ig G1型;单抗的腹水效价分别为1∶51 200、1∶409 600和1∶102 400。将这3株杂交瘤细胞连续培养20代,在第20代仍有很高的分泌抗体的能力,表明其稳定性较好。Western-blot检测结果表明,这3株单抗与K205R重组蛋白有良好的反应性和特异性。上述结果表明,本研究制备的这3株杂交瘤细胞株能够稳定分泌抗体,分泌的抗体特异性高,为非洲猪瘟诊断技术的研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研究

采用差速离心和蔗糖不连续密度梯度离心法提纯猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北京地区分离株BJ-4病毒抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规杂交瘤技术制备杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌PRRSV抗体的单克隆杂交瘤细胞株,命名为GE3.经过鉴定,GE3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亚类为IgG1;分子质量为161.64 ku;腹水效价为18×104;不与猪瘟病毒(HCV)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应;蛋白质印迹(Westren-blotting)试验结果表明,该株单克隆抗体为针对核衣壳蛋白(NP)的单克隆抗体;腹水与欧洲株(Lv)、美洲株(VR-2332)和北京分离株BJ-1、BJ-2、BJ-5、BJ-6均能发生反应,说明其所针对的位点为NP上的保守位点.     

抗鸡致病性大肠埃希氏菌O_(88)单克隆抗体的研究

用纯化的鸡致病性大肠埃希氏菌O88 菌株( MG38e) 热灭活抗原免疫BALB/c 雌性小鼠,再用该菌株粗提的脂多糖尾静脉注射加强免疫后,取其脾细胞与SP2/0 细胞融合,经有限稀释法克隆,用间接ELISA 及凝集试验(IHT) 筛选,获得4 株能稳定分泌该菌株单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞培养液ELISA 和IHT 效价分别为1∶100 ～1∶1000 和3 log2 ～4 log2 ;腹水效价分别为1∶100 ～1∶4000 和4 log2 ～10 log2 。这4 种单克隆抗体( E1 、E2 、E3 、E4) 均能与鉴定的7 株O88菌株发生凝集反应,E4 株还能与O78菌株发生凝集反应。用单克隆抗体对分离的45 株鸡致病性大肠埃希氏菌进行血清型鉴定,结果5 株为O88 ,与用单因子血清鉴定的结果一致。     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术获得了1株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞2D6。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,诱生腹水抗体效价达1∶6×104,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗原之间均无交叉反应;ELISA阻断试验表明,TGEV特异性阳性血清对TGEV-McAb有明显的阻断作用,该McAb所识别的抗原是TGEV所特有的抗原决定基。     

鸭MAPK1蛋白的原核表达和单克隆抗体的制备

为研制鸭丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)单克隆抗体,从樱桃谷鸭脾样品扩增鸭MAPK1基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建鸭MAPK1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白,经纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用间接ELISA筛选分泌抗鸭MAPK1的单克隆杂交瘤细胞株,进行3次亚克隆纯化后,制备小鼠腹水。采用间接ELISA测定腹水效价,用Western-blot检测其特异性,并进行单克隆抗体的亚类鉴定。测序结果表明,鸭MAPK1基因编码区全长1 107bp,编码369个氨基酸。SDS-PAGE检测结果表明,本研究获得了可溶性的42ku的鸭MAPK1重组蛋白。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,得到2株抗鸭MAPK1的阳性杂交瘤细胞株,腹水效价均达到1∶12 800以上,均为IgG1亚类。Western-blot分析结果表明,制备的单克隆抗体具有良好的免疫反应特异性。以上结果表明,本研究成功制备了抗鸭MAPK1的单克隆抗体,为进一步研究其在先天免疫反应中的作用奠定了基础。