绵羊痘苗种毒细胞培养的产斑条件

据材料介绍,在液体培养基内形成CPE(细胞病变)和某些不形成CPE的病毒,可在琼脂覆盖层下形成明晰的蚀斑。笔者结合绵羊痘病毒在绵羔羊睾丸单层细胞上产生CPE的特点,为排除日前羊痘苗生产中测毒羊因健康状况、免疫状况、个体差异及饲养管理条件等对检测结果的影响,对绵羊痘苗用种毒一羊痘鸡胚化羊体反应毒进行了产斑条件的观察。     

腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价

本研究旨在获得腐败梭菌α毒素(csa)的重组突变体,并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcsam4。将Gcsam4克隆至原核表达载体p ET-30(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rcsam4。利用Western-blot检测rcsam4与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后,将rcsam4与Montanide ISA 206佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素,来检测rcsam4对家兔的免疫保护效果。结果表明,rcsam4主要以包涵体的形式存在,且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示,9.85 g/m L的蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性试验显示,5.5×103g/kg的剂量对小鼠无致死性;免疫rcsam4后,每毫升的一免兔血清可中和50~70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免兔血清可中和110~130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔全部死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果表明,rcsam4在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

MDV-gB重组痘苗病毒诱导免疫的检测及保护性

用MDV gB重组痘苗病毒RVV gB、HVT冻干疫苗、痘苗病毒WR株分别按试验程序对细胞免疫及体液免疫检测试验中的 1日龄SPF鸡进行免疫接种 ,并于 15日龄时对试验各组鸡用GA株强毒攻击 ,经IFA抗体检测 ,及以PHA为有丝分裂原的淋巴细胞转化检测 ,结果表明 ,重组病毒和HVT冻干疫苗免疫鸡均获得了较高保护 ,体液免疫效果差异不显著 ;细胞免疫效果在攻毒前差异不显著 ,但攻毒后第 2d开始 ,RVV gB免疫组鸡的淋巴细胞转化率明显高于HVT冻干疫苗免疫组鸡。     

腐败梭菌α毒素重组突变体的免疫保护力评价

本研究旨在获得腐败梭菌α毒素(csa)的重组突变体,并评价该重组毒素的毒力及免疫原性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计,同时引入包括第86位半胱氨酸突变为亮氨酸及第296位的天冬氨酸、第301位的组氨酸和第342位的色氨酸突变为丙氨酸的4个氨基酸突变,经人工合成获得基因片段Gcsa_(m4)。将Gcsa_(m4)克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rcsa_(m4)。利用Western-blot检测rcsa_(m4)与腐败梭菌α毒素抗血清的反应性,并采用Vero细胞和小鼠检测其毒性。随后,将rcsa_(m4)与Montanide ISA 206佐剂以1∶1(V/V)的比例混合乳化制备疫苗并免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。二免后第21天对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的腐败梭菌毒素,来检测rcsa_(m4)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rcsa_(m4)主要以包涵体的形式存在,且能够与腐败梭菌抗血清反应。Vero细胞毒性试验显示,9.85μg/m L的蛋白仍无细胞毒性;小鼠安全性试验显示,5.5×10~3μg/kg的剂量对小鼠无致死性;免疫rcsa_(m4)后,每毫升的一免兔血清可中和50～70个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;每毫升的二免兔血清可中和110～130个小鼠MLD的腐败梭菌毒素;1个家兔MLD的腐败梭菌毒素攻毒后,对照组家兔全部死亡,免疫组家兔得到了100%(4/4)的保护。以上结果表明,rcsa_(m4)在丧失毒性的同时还保留了良好的免疫原性,从而为腐败梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

重组鸡白细胞介素-6-2融合蛋白对鸡T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫活性的影响

为研究重组鸡白细胞介素-6-2融合蛋白(rChIL-6-Linker-ChIL-2)对鸡体免疫功能的影响,采用MTS法检测重组融合蛋白在28日龄SPF鸡体内接种后不同时间对外周血淋巴细胞(PBLC)中T淋巴细胞和脾B淋巴细胞增殖活性的影响,采用流式细胞术检测它对鸡PBLC中CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞百分含量及CD4+/CD8+比值的影响。结果显示,接种后第7~35天,重组融合蛋白可显著提高鸡体PBLC中T淋巴细胞和脾中B淋巴细胞的增殖活性,两者活性分别高于单一rChIL-2蛋白或单一rChIL-6蛋白对照、低于或接近于rChIL-6蛋白+rChIL-2蛋白混合物。接种后第7~21天,重组融合蛋白可显著提高CD3+CD4+T淋巴细胞百分含量、降低CD3+CD8+T淋巴细胞百分含量,显著提高CD4+/CD8+比值,其活性显著高于单一rChIL-6蛋白或单一rChIL-2蛋白对照,但与rChIL-6蛋白+rChIL-2蛋白混合组差异不显著。结果表明,重组融合蛋白在鸡体内可显著促进T、B淋巴细胞增殖,提高CD3+CD4+T淋巴细胞百分含量和CD4+/CD8+比值,从而增强鸡体的体液免疫和细胞免疫功能;重组融合蛋白在体内发挥了ChIL-6和ChIL-2的协同作用活性。     

三株胸膜肺炎放线杆菌基因缺失株免疫原性的研究

为深入研究猪传染性胸膜肺炎基因工程弱毒活疫苗的生物学特性和免疫原性,分别以本实验室构建的血清7型胸膜肺炎放线杆菌(APP)基因缺失株apxⅡC-/Kan+、apxⅡC-/ⅠN+和血清5型APP的基因缺失株SW1ΔⅠC为研究对象,对其进行研究。溶血活性试验证实,突变株完全失去了溶血活性。细胞毒性试验证实,缺失株SW1ΔⅠC的细胞毒性完全丧失,缺失株apxⅡC-/Kan+和apxⅡC-/ⅠN+有轻微的细胞毒性。遗传稳定性试验证实,3株缺失株在体内传5代均不会发生回复突变。毒力试验结果显示,基因缺失株apxⅡC-/Kan+、apxⅡC-/ⅠN+和SW1ΔⅠC对小鼠的半数致死量分别为亲本株的5倍、7倍和15倍。3株缺失株分别免疫小鼠后,以10LD50血清1型、5型和7型APP的剂量攻毒,小鼠的保护率可达100%。试验结果表明,3株缺失株的毒力明显降低,并能提供有效的保护力。本研究为进一步以突变株为基因工程弱毒活疫苗的研究奠定了一定基础。     

微小隐孢子虫P23基因真核表达质粒在HeLa细胞中的表达及其免疫小鼠血清抗体效价的检测

为观察微小隐孢子虫P23基因真核重组质粒在He La细胞中的表达及免疫小鼠血清抗体产生情况,通过设计特异性引物,利用PCR技术,对微小隐孢子虫卵囊基因组DNA进行P23基因扩增;将扩增产物插入真核表达载体p VAX-1中,构建重组真核表达质粒p VAX1-P23,转染He La细胞,运用间接免疫荧光法及Western-blot技术,验证重组质粒在He La细胞中的表达情况;将重组质粒p VAX1-P23免疫小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体产生情况。结果显示,成功地扩增了长度约为336 bp的微小隐孢子虫P23基因;双酶切和序列测定结果显示,构建的真核重组表达质粒p VAX1-P23中外源基因序列和插入位置正确;间接免疫荧光法及Western-blot分析显示,p VAX1-P23真核重组表达质粒在He La细胞中被成功表达;小鼠免疫重组质粒2周后,即可检测到抗体产生,直至第8周试验结束。结果表明成功地构建了真核重组表达质粒p VAX1-P23,该重组质粒能在He La细胞和小鼠体内表达,并诱导小鼠产生显著的体液免疫反应,为进一步开展隐孢子虫P23蛋白特性研究、研制抗隐孢子虫病核酸疫苗奠定了基础。     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

脑炎原虫病兔血液中几种免疫指标的检测

为了调查脑炎原虫病兔血液中几种免疫指标的变化,采用E-玫瑰花环试验、流式细胞仪检测、间接ELISA试验和双向免疫琼脂扩散试验对12只病兔和12只对照兔血液中的T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和IgG进行了测定。结果显示,脑炎原虫病兔与对照兔相比,E-玫瑰花环形成率增高,CD4+T细胞没有明显变化,但CD8+T细胞明显增多,CD4+/CD8+T细胞的比值变小,血液中IgG含量增高,双向免疫琼脂扩散时形成沉淀线的抗体稀释倍数增大。据此认为,脑炎原虫病兔的体液免疫和细胞免疫均增强,但以细胞免疫为主,CD4+/CD8+T细胞的比值变小可能与兔脑炎原虫所引起的隐性或慢性感染有关。     

TSOL18抗原重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗对小鼠的免疫保护作用

用构建好的活栽体疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)免疫小鼠,检测小鼠血清中IgG、IgM和肠液中IgA抗体的产生及各免疫组织重组疫苗株的分布情况,分析小鼠脾细胞亚型的分化,探讨了重组疫苗的免疫保护效果.结果显示,在免疫后第7 d,小鼠血清中有抗TSOL18 IgM产生,在二免后第28 d,gG的D492nm值达到0.645,在二免后第42 d,肠液中有抗TSOL18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种方式的免疫应答;小鼠免疫后第21 d在脾中仍能检测到大量的重组疫苗株,表明TSOL18重组蛋白的表达没有影响重组疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)的定居能力;免疫小鼠的CD4 、CD8 T淋巴细胞数目明显增多,D4 /CD8 T细胞比值也显著增高(P＜0.01),提示重组疫苗可能通过提高CD4 /CD8 T细胞比值来发挥免疫作用.     

脑心肌炎病毒VP1基因重组腺病毒的构建及对小鼠免疫效果的研究

为构建脑心肌炎病毒(EM CV)VP1基因的重组腺病毒,以期为EMCV疫苗研制提供试验依据。扩增EMCV VP1基因并与载体p Yr-adshuttle-4连接构建p Yr-ads-4-VP1穿梭载体;穿梭质粒通过体外重组与腺病毒载体进行重组,获得p Ad-VP1-EG FP重组腺病毒载体,将此载体于H EK 293细胞中包装最终成功获得r Ad-VP1-EGFP重组腺病毒,并测定其TCID50;构建的重组腺病毒感染细胞后在基因水平、蛋白水平对VP1进行检测;最后通过对小鼠免疫重组腺病毒后进行EMCV攻毒试验,验证其免疫效果。结果显示,成功构建了EMCV VP1基因重组腺病毒r Ad-VP1-EGFP,测得其TCID50为10-8.5/m L;感染细胞后基因水平及蛋白水平均可检测到VP1基因的表达;重组腺病毒免疫小鼠后的存活情况表明,重组腺病毒对小鼠有较好的免疫效果,且二次免疫后保护率显著高于单次免疫。结果表明,本试验成功制备了EMCV基因重组腺病毒,且对小鼠具有较好的免疫效果,可为进一步开发EMCV基因工程疫苗奠定基础。     

抗传染性支气管炎病毒中药的研究

用细胞培养法、鸡胚培养法对车前子、麦冬等 4 0种中药进行抗传染性支气管炎病毒(IBV)的筛选试验。通过细胞病变 (CPE)抑制试验发现 ,石榴皮等 5种中药有抑制CPE的作用。培养细胞有 2 0 %发生CPE ,认为这些中药有抗IBV的作用。应用空斑形成抑制试验对 5种抗IBV中药进行复筛 ,结果表明 5种中药均有不同程度的抑制病毒空斑形成作用 ,其中以石榴皮等 2种中药作用较强 ,空斑形成抑制率可达 98%以上。应用鸡胚培养法对 5种中药进行抗IBV试验 ,结果发现 5种中药均显著地减少了鸡胚病变及胚体的死亡 ,其中以石榴皮等 2种中药抑制胚体病变的作用最强。通过不同加药时间观察到在接毒前 4 8h给药 ,有 2种中药具有明显抑制CPE的作用 ;接毒同时加药以及接毒后 1h加药 ,这 5种中药均能明显抑制CPE。     

鹅细小病毒VP3基因疫苗与弱毒疫苗诱导小鼠免疫应答的比较

为阐明小鹅瘟基因疫苗与弱毒疫苗诱导细胞免疫和体液免疫的不同机理,将小鹅瘟VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别按6μg/只基因枪轰击和100 μg/只肌肉注射,小鹅瘟弱毒疫苗按100 μL/只肌肉注射免疫BALB/c小鼠,同时以pcDNA3.1(+)和生理盐水为对照.于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77、105 d采集抗凝血,用淋巴细胞转化试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)分别检测小鼠外周血T淋巴细胞的转化效果和CD4+、CD8+T淋巴细胞的动态变化,另外,在以上10个时间段以及免疫后第133、161、189、217 d分别采集凝血,用间接ELISA检测小鼠特异性IgG抗体水平.结果显示,pcDNA-GPv-VP3免疫小鼠的外周血T淋巴细胞对ConA刺激的反应,诱导的CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫功能和血清IgG抗体水平在不同时间段都显著或极显著高于弱毒疫苗免疫组.3个免疫组小鼠都能诱导产生细胞免疫和体液免疫应答,并且基因疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫和体液免疫应答比弱毒疫苗免疫组强.     

反义RNA重组逆转录病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

为探求一种快速检测反义RNA重组逆转录病毒效价的新方法,用脂质体介导法将反义RNA重组逆转录病毒载体pLXSA、pLXSB分别转染包装细胞系PA317,经G418筛选,获得数个稳定的产毒细胞克隆,择优挑选7个细胞克隆扩增培养,收集细胞上清,用异硫氰酸胍-酚一步法提取病毒RNA,进行逆转录套式PCR,检测细胞上清中的反义RNA重组逆转录病毒效价,同时用传统方法(小鼠成纤维放大法)进行测定。2种方法检测结果的比较表明,逆转录套式PCR法的特异性和敏感性均高于小鼠成纤维放大法,是一种敏感性高、特异性强、操作简便、快速的检测逆转录病毒效价的新方法。     

表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组新城疫病毒在小鼠中的免疫原性

为了防控严重威胁我国的外来动物疫病非洲猪瘟,应用反向遗传操作系统构建了表达非洲猪瘟病毒(ASFV)p30蛋白的重组新城疫病毒rNDV-p30。通过免疫印迹试验鉴定了ASFV p30蛋白的表达,连续传代后经RT-PCR证实了外源基因稳定存在。另外,比较了该重组病毒和亲本病毒对鸡胚和雏鸡的致病性以及在BHK21细胞上的生长特性;将重组病毒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过酶联免疫吸附试验检测小鼠血清中诱导产生的p30蛋白特异性抗体水平。结果显示,相对亲本病毒而言,重组病毒在细胞上的生长能力略有降低,毒力被致弱;免疫小鼠可以产生针对ASFV p30蛋白的特异性IgG。重组病毒rNDV-p30对于非洲猪瘟的防控具有重要的战略储备意义。     

日本血吸虫重组蛋白LHD-Sj23-GST诱导的细胞免疫应答和免疫保护效果

为探讨日本血吸虫重组蛋白LHD-Sj23-GST与3种不同类型佐剂(弗氏佐剂、ISA 206佐剂、ISA70M佐剂)配伍后免疫小鼠诱导的细胞免疫应答及免疫保护效果,应用流式细胞术检测并比较该重组蛋白配伍3种佐剂3次免疫后小鼠脾细胞中的CD4+、CD8+T细胞及细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10水平;3次免疫后小鼠人工攻击感染日本血吸虫尾蚴,6周后经肝门静脉灌注冲虫,计数各组平均虫体数并计算减虫率。与PBS对照组相比,LHD-Sj23-GST/FA和LHD-Sj23-GST/70M免疫组的CD4+T细胞显著升高(P<0.05),LHD-Sj23-GST/206免疫组未呈现明显变化;3种不同佐剂配伍LHD-Sj23-GST免疫组CD8+T细胞水平均显著降低(P<0.05);与PBS对照组相比,免疫组的IFN-γ及IL-10水平升高,而IL-4水平降低。LHD-Sj23-GST/FA、LHD-Sj23-GST/206和LHD-Sj23-GST/70M免疫组与PBS对照组相比,分别获得65.52%、51.72%和51.72%的减虫率;而相较于各自的佐剂对照组,则分别获得58.76%,26.31%,54.28%的减虫率。结果表明,用重组蛋白LHD-Sj23-GST配伍3种不同类型佐剂免疫小鼠,均刺激产生了偏向Th1型的细胞免疫应答,且都对小鼠诱导了较高的免疫保护作用。     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针,建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来,而不与其他猪源病毒发生非特异反应,分别可检测到初始模板中41.8和81.5个拷贝的病毒RNA,与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近,两种方法对152份样品检测的符合率达96.9%~100%。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测,证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性,可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

2型猪链球菌动物致病性试验

用5株2型猪链球茵对BALB/c小鼠、猪、兔和普通小白鼠进行攻毒试验,其中SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠有致病性,其LD50分别为2.1×106、3.1×107、5.3×10 7、9.4×107,SS2-N株以2.8×108对BALB/c小鼠不致死.SS2-1株对猪有致病性,LD50为4.2×107,ID50为1.33×106,而以8×108活菌攻击对兔和普通小白鼠均未致病.表明2型猪链球茵可人工感染BALB/c小鼠和猪引起发病,2型猪链球菌MRP和EF毒力因子的表现型与其对BALB/c小鼠的致病性无相关关系,BALB/c小鼠可用作疫苗免疫试验的动物模型.     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

环丙沙星和恩诺沙星联合肝毒性及其机制研究

研究动物性食品中常见抗菌药环丙沙星(Ciprofloxacin,CFX)和恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)残留联合肝毒性及其分子机制。以小鼠肝实质细胞AML12细胞为模型,通过结晶紫染色法与联合指数计算确定CFX、ENR引起协同毒性的浓度比,并使用蛋白免疫印迹法、Annexin V-FITC/PI双染法等方法探究两者联用产生协同毒性的分子机制。结果显示:当CFX、ENR以浓度比2︰1作用于AML12细胞时,可显著抑制AML12细胞增殖,诱导细胞凋亡,产生协同毒性。CFX可激活内质网应激,从而上调Bim表达量。同时ENR抑制Akt的激活,从而诱导Bim的转录。两者联用后显著上调Bim蛋白的表达(P0.01),激活caspase-3,切割多聚DAP-核糖聚合酶(PARP),最终诱导caspase依赖型细胞凋亡。结论:CFX与ENR可通过诱导AML12细胞发生caspase依赖型细胞凋亡,从而产生协同毒性。