弓形虫代谢分泌抗原对猪T细胞亚群的影响

为了研究弓形虫代谢分泌抗原对仔猪T细胞亚群及抗体的影响,将仔猪随机分为6组,每组5只,分别为E/SA组、E/SA+CPG(未乳化)组、E/SA+CPG组、E/SA+IL-2组、E/SA+IL-2+CPG组及对照组.分别于免疫前、免疫后第2周、免疫后第4周、感染后第1周及感染后第2周采集仔猪外周血,用流式细胞仪对各试验组外周血中CD4+及CD8+T淋巴细胞亚群的动态变化规律进行检测,用IHA对抗弓形虫抗体水平做检测.结果显示,弓形虫代谢分泌抗原免疫仔猪后第4周,免疫组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞水平和特异性抗体效价与对照组相比均有大幅度升高;感染后第1周,免疫组CD4+T细胞水平及CD4+/CD8+比值较感染前有不同程度降低,感染后第2周,免疫组CD4+T细胞水平及CD4+/CD8+比值上升至免疫后水平,CD8+水平下降,感染后特异性抗体效价进一步升高.表明,弓形虫代谢分泌抗原能够提高仔猪外周血CD4+及CD8+T淋巴细胞水平和特异性抗体水平.     

保定地区奶牛源微小隐孢子虫子孢子表面抗原Cp23免疫特性的研究

为了解河北省保定地区奶牛源微小隐孢子虫子孢子表面抗原Cp23的免疫特性,将重组质粒p ET28-Cp23表达产物纯化后免疫4周龄BALB/c小鼠,进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果显示,试验组的CD4~+/CD8~+T淋巴细胞比值和Ig G水平增加明显,IL-12及IFN-γ的质量浓度亦都增高,与对照组比较均有统计学意义(P0.01)。结果表明,用重组蛋白Cp23免疫小鼠后可产生高水平的体液免疫和细胞免疫。本研究为保定地区隐孢子虫病的预防提供了材料。     

黄参多糖的提取及其对雏鸡细胞免疫应答的影响

为探讨黄参多糖(SGP)的免疫活性作用,采用微波处理法从黄参中提取制备SGP,并进行红外光谱分析。采用MTT法比较不同作用浓度的SGP对鸡外周血T淋巴细胞体外增殖作用。采用雏鸡外周血T淋巴细胞亚群检测,比较不同作用浓度的SGP对雏鸡细胞免疫的影响。结果显示,在微波处理90min时,SGP得率高达5.85%。红外光谱分析表明,提取物为SGP。外周血T淋巴细胞增殖试验表明,SGP能够刺激和促进鸡淋巴细胞增殖,并且能协同刀豆素A刺激鸡外周血T淋巴细胞增殖,这种刺激作用都具有一定的剂量效应关系,且以SGP终作用浓度在250mg/L时效果最佳。研究进一步表明,SGP能够显著提高雏鸡外周血CD4+/CD8+淋巴细胞比值,增强雏鸡细胞免疫能力、调节T细胞亚群分化,以2mg/kg SGP剂量组效果最佳。当SGP与新城疫病毒LaSota疫苗联合使用时,具有明显的免疫协同作用,也能提高雏鸡外周血CD4+/CD8+淋巴细胞比值。结论:SGP有免疫增强作用,并能促进机体细胞免疫应答。     

重组鸡白细胞介素-6-2融合蛋白对鸡T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫活性的影响

为研究重组鸡白细胞介素-6-2融合蛋白(rChIL-6-Linker-ChIL-2)对鸡体免疫功能的影响,采用MTS法检测重组融合蛋白在28日龄SPF鸡体内接种后不同时间对外周血淋巴细胞(PBLC)中T淋巴细胞和脾B淋巴细胞增殖活性的影响,采用流式细胞术检测它对鸡PBLC中CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞百分含量及CD4+/CD8+比值的影响。结果显示,接种后第7~35天,重组融合蛋白可显著提高鸡体PBLC中T淋巴细胞和脾中B淋巴细胞的增殖活性,两者活性分别高于单一rChIL-2蛋白或单一rChIL-6蛋白对照、低于或接近于rChIL-6蛋白+rChIL-2蛋白混合物。接种后第7~21天,重组融合蛋白可显著提高CD3+CD4+T淋巴细胞百分含量、降低CD3+CD8+T淋巴细胞百分含量,显著提高CD4+/CD8+比值,其活性显著高于单一rChIL-6蛋白或单一rChIL-2蛋白对照,但与rChIL-6蛋白+rChIL-2蛋白混合组差异不显著。结果表明,重组融合蛋白在鸡体内可显著促进T、B淋巴细胞增殖,提高CD3+CD4+T淋巴细胞百分含量和CD4+/CD8+比值,从而增强鸡体的体液免疫和细胞免疫功能;重组融合蛋白在体内发挥了ChIL-6和ChIL-2的协同作用活性。     

桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠CD4~+和CD8~+ T淋巴细胞亚群的影响

将40只昆明种小鼠随机分成4组:空白对照组、阴性对照组、蒿甲醚组和桦褐孔菌多糖组,每组10只.每组小白鼠腹腔接种弓形虫RH株速殖子1 × 102个,建立小鼠急性弓形虫感染模型.采用流式细胞仪检测脾中CD4+、CD8+T细胞百分数及CD4+/CD8+T细胞比例,探讨了桦褐孔菌多糖对感染弓形虫小鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的影响.结果显示,桦褐孔菌多糖组中CD4+T细胞百分数及CD4+/CD8+T细胞比例与其他3组比较差异极显著(P<0.01);阴性对照组CD8+T细胞百分数显著高于桦褐孔菌多糖组(P<0.05),与其他2组比较差异极显著(P<0.01).结果表明,桦褐孔菌多糖可有效调节感染弓形虫小白鼠的CD4+T细胞百分数及CD4+/CD8+比例,达到抗弓形虫目的.     

鹅细小病毒VP3基因疫苗与弱毒疫苗诱导小鼠免疫应答的比较

为阐明小鹅瘟基因疫苗与弱毒疫苗诱导细胞免疫和体液免疫的不同机理,将小鹅瘟VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别按6μg/只基因枪轰击和100 μg/只肌肉注射,小鹅瘟弱毒疫苗按100 μL/只肌肉注射免疫BALB/c小鼠,同时以pcDNA3.1(+)和生理盐水为对照.于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77、105 d采集抗凝血,用淋巴细胞转化试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)分别检测小鼠外周血T淋巴细胞的转化效果和CD4+、CD8+T淋巴细胞的动态变化,另外,在以上10个时间段以及免疫后第133、161、189、217 d分别采集凝血,用间接ELISA检测小鼠特异性IgG抗体水平.结果显示,pcDNA-GPv-VP3免疫小鼠的外周血T淋巴细胞对ConA刺激的反应,诱导的CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫功能和血清IgG抗体水平在不同时间段都显著或极显著高于弱毒疫苗免疫组.3个免疫组小鼠都能诱导产生细胞免疫和体液免疫应答,并且基因疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫和体液免疫应答比弱毒疫苗免疫组强.     

兔脑炎原虫引起脑星形胶质细胞增殖和胶质纤维酸性蛋白的表达

为了研究兔脑炎原虫引起脑组织星形胶质细胞增生的特点和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的丰度,经特殊染色、免疫组织化学染色和免疫印迹技术对30只病兔和10只对照兔的脑组织进行了详细的研究。结果显示,病兔的脑组织出现了弥漫性或局灶性非化脓性脑炎病变及不同形态的特异性肉芽肿。用改良的革兰染色可在肉芽肿的上皮样细胞及坏死组织中检出蓝色的兔脑炎原虫;用甲基绿派若宁染色可在上皮样细胞的胞质中检出红色的兔脑炎原虫;用抗-GFAP免疫组织化学染色,见病兔脑组织中有大量星形胶质细胞增生,在脑肉芽肿及血管套周围也有大量反应态星形胶质细胞,使之与正常脑组织隔离,增生的星形胶质细胞的足突在血管周围、脑软膜下和室管膜细胞的基底部形成厚层屏障膜。用免疫印迹技术检测,病兔脑组织中GFAP表达的丰度明显高于对照兔,且与抗-GFAP免疫组织化学染色的结果相一致。研究结果表明,兔脑炎原虫能引起脑组织中星形胶质细胞增生,反应态的星形胶质细胞形成的各种屏障膜可保护脑组织免受更大的损伤。     

TSOL18抗原重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗对小鼠的免疫保护作用

用构建好的活栽体疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)免疫小鼠,检测小鼠血清中IgG、IgM和肠液中IgA抗体的产生及各免疫组织重组疫苗株的分布情况,分析小鼠脾细胞亚型的分化,探讨了重组疫苗的免疫保护效果.结果显示,在免疫后第7 d,小鼠血清中有抗TSOL18 IgM产生,在二免后第28 d,gG的D492nm值达到0.645,在二免后第42 d,肠液中有抗TSOL18分泌性IgA抗体产生,表明重组疫苗能诱导小鼠产生较强的抗体水平和激发多种方式的免疫应答;小鼠免疫后第21 d在脾中仍能检测到大量的重组疫苗株,表明TSOL18重组蛋白的表达没有影响重组疫苗X4550(pYA3341-TSOL18)的定居能力;免疫小鼠的CD4 、CD8 T淋巴细胞数目明显增多,D4 /CD8 T细胞比值也显著增高(P＜0.01),提示重组疫苗可能通过提高CD4 /CD8 T细胞比值来发挥免疫作用.     

O型FMD灭活疫苗免疫后呈现“灰色区”抗体应答的猪血液IL-12水平及淋巴细胞亚群的分析

为掌握口蹄疫抗体效价处于"灰色区"的免疫猪群的免疫水平差异,对66头猪用不同剂量的O型口蹄疫疫苗免疫,免疫后第28天检测免疫猪抗体水平,并用疫苗同源强毒攻击,采用ELISA检测IL-12水平,用流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群比例。结果显示,在O型口蹄疫免疫抗体灰色区,被保护猪免疫后第28天血清IL-12水平较免疫前极显著升高(P0.01),未被保护猪略有升高,但差异不显著(P0.05);被保护猪外周血CD21+细胞亚群比例升高且差异极显著(P0.01),CD3+CD4+T细胞比例显著升高(P0.05),CD3+CD8+T细胞亚群比例变化不显著(P0.05),而未被保护猪CD21+细胞亚群比例变化不显著(P0.05),CD3+CD4+T细胞比例降低且差异显著(P0.05),CD3+CD8+T细胞亚群比例降低且差异极显著(P0.01)。结果表明,IL-12水平、外周血CD21+细胞亚群比例、CD3+CD4+T细胞亚群比例、CD3+CD8+T细胞亚群比例的差异是引起免疫抗体灰色区保护与不保护的影响因素。     

猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。     

日本血吸虫抱雌沟蛋白DNA疫苗的研究

为构建含日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)完整ORF的核酸疫苗,评估该核酸疫苗在小鼠体内诱导抗血吸虫感染的免疫保护效果及其保护机制,将编码日本血吸虫大陆株抱雌沟蛋白基因ORF片段克隆到真核表达载体pVAX1中,用重组质粒pVAX1-SjGCP三次肌肉注射BALB/c小鼠,攻击感染血吸虫尾蚴,攻击感染后第42天剖杀小鼠冲虫,计算减虫率及肝和粪便的减卵率,评估其免疫保护效果。用流式细胞术(FCM)检测第3次免疫后小鼠淋巴细胞亚群CD4+、CD8+占总淋巴细胞的百分比及细胞因子IL-4、IFN-γ表达水平,探讨核酸疫苗的免疫机制。结果显示,小鼠经pVAX1-SjGCP质粒免疫后诱导了31.9%的减虫率,以及47.85%、68.04%的肝减卵率和粪便减卵率,与PBS组差异显著;pVAX1-SjGCP免疫组淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分比增加,细胞因子IFN-γ及特异性IgG水平提高,与pVAX1组差异显著。结果表明,血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗能够诱导宿主细胞免疫和体液免疫应答,产生Th1/Th2型混合的细胞免疫反应,具有一定的抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

负载灭活口蹄疫病毒树突状细胞启动的CD4~+T细胞应答

为研究负载灭活口蹄疫病毒(iFMDV)树突状细胞对CD4+T细胞的活化效应,用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白介素-4(rmIL-4)将小鼠外周血单核细胞诱导分化成树突状细胞(MoDCs),以信号阻断法制备淋巴结CD4+T细胞,利用负载iFMDV的MoDCs与CD4+T细胞共培养,以iFMDV+MoDCs作为对照,用ELISA检测不同时间培养上清液中IFN-γ的含量。用溶酶体抑制剂处理MoDCs,2h后再负载iFMDV,并与CD4+T细胞共培养,对照组则用iFMDV+MoDCs+CD4+T细胞,用ELISA检测不同时间培养上清液中IFN-γ的含量。结果显示,在共培养后第9和48小时,CD4+T细胞组与对照组比较差异均极显著(P<0.01)。共培养后第24和36小时,CD4+T细胞组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。溶酶体抑制剂处理后,共培养第9、24、36和48小时组与对照组比较,均有显著性差异(P<0.05)。这表明MoDCs可通过溶酶体-MHC-Ⅱ途径向CD4+T细胞提呈iFMDV抗原,并且活化的CD4+T细胞可分化成Th1细胞。     

毒害艾美球虫二次感染雏鸡外周血液免疫功能的变化

将180只14日龄雏鸡随机分为毒害艾美球虫(Eimeria necatrix)初次感染组、二次感染组和对照组,应用免疫SPA菌体花环、间接ELISA及细胞培养技术和四甲基偶氮唑盐(MTT)测定法对相关免疫学指标进行了检测,以研究毒害艾美球虫二次感染对雏鸡外周血液免疫功能变化的影响。结果显示,毒害艾美球虫二次感染雏鸡外周血液T、B淋巴细胞数量及其对ConA或PMA的增殖反应和血清IgG、IgM、IgA免疫球蛋白含量均不同程度地高于未感染毒害艾美球虫的对照组雏鸡。证实毒害艾美球虫二次感染雏鸡外周血液的细胞免疫和体液免疫功能均明显提高。     

不同光照条件下褪黑素对鸡鸭鹌鹑外周血淋巴细胞及其亚群变化的影响

为探讨不同褪黑素水平对禽类机体免疫系统的调节作用,通过控制不同光照条件,分3组(短光照组、长光照组和对照组)饲养鸡45只、鸭45只、鹌鹑45只,采用荧光双色染色法和流式细胞仪分别检测鸡、鸭、鹌鹑外周血中CD3 、CD4 、CD8 T淋巴细胞及其亚群和Bu-1a B淋巴细胞数量变化。结果,短光照组由于体内褪黑素水平较高,外周血中CD3 CD4 T细胞、CD3 CD8 T细胞、Bu-1a B细胞及白细胞总数都有不同程度升高,且与对照组相比差异显著;长光照组由于体内褪黑素分泌较少,外周血中CD3 CD4 T细胞、CD3 CD8 T细胞、Bu-1a B细胞及白细胞总数都有不同程度降低,且与对照组相比差异显著。结果表明,内源性褪黑素对鸡、鸭、鹌鹑外周血中淋巴细胞及其亚群的数量变化有显著影响。     

猪囊虫TS21抗原DNA接种小鼠的免疫应答

将 4 0只BALB/c小鼠随机分为 2组 ,A组以VR10 2 0免疫作为对照 ,B组以TS2 1抗原基因的真核表达型质粒VTS2 1免疫。用ELISA检测免疫小鼠IgG总量和特异性抗体水平 ,MTT比色法检测小鼠脾淋巴细胞伴刀豆蛋白A(ConA)刺激的增殖反应及IL 2的诱生活性 ,常规法检测外周血免疫细胞数量的动态变化。结果显示 ,VTS2 1免疫小鼠血清的IgG含量和特异性抗体效价显著高于对照组小鼠 ;免疫小鼠脾淋巴细胞ConA刺激增殖反应和IL 2诱生活性均比对照组小鼠显著增强 ;免疫小鼠的淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞的数量也显著超过对照组。免疫小鼠的细胞和体液免疫反应显著增强 ,表明VTS2 1具有很强的免疫激活作用 ,有进一步研制开发成为猪囊虫病DNA疫苗的潜力     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒(pCI-GP5和pcDNA-U-GP5)分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力,LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性,并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现,2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周,pCI-GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA-U-GP5质粒免疫组;而pcDNA-U-GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4-CD8 T细胞比例明显高于pCI-GP5组。表明,GP5基因可诱导产生较高的免疫反应,泛素与GP5的融合表达可增强PRRSV GP5诱导的细胞免疫反应。     

猪圆环病毒2型感染裸鼠及BALB/c小鼠的研究

用猪圆环病毒2型(PCV2)经腹腔注射BALB/c小鼠及裸鼠各15只,每隔2周1次,共感染3次。BALB/c小鼠初次、再次感染后均未出现明显的临床症状,仅有2只小鼠出现病理变化;从血清中可检测到PCV2核酸及其ORF2抗体;同时淋巴细胞增殖反应显著增强,NK和CTL细胞杀伤率显著升高;CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞及CD19+B淋巴细胞数量显著减少。裸鼠也未出现明显的临床症状,从血清中可检测到PCV2核酸,但未检测到PCV2 ORF2抗体;除NK细胞杀伤率显著升高外,其余免疫学指标无显著改变。结果表明,BALB/c小鼠比裸鼠对PCV2易感,各项免疫学指标变化与PCV2感染猪一致,但不表现临床症状,仅个别BALB/c小鼠出现病理变化,说明BALB/c小鼠对PCV2不如猪易感。