禽流感病毒N8亚型神经氨酸酶基因的克隆和全序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒A/Duck/Australia/341/83(H15N8),通过RT-PCR获得了NA基因全长,连接并转化,增菌培养后,提取阳性质粒进行序列测定,获得了禽流感病毒N8亚型的NA基因序列,分析了NA8基因与其他流感病毒神经氨酸酶基因的相互关系。结果显示,所获得的NA基因片段全长1459bp,最大开放阅读框编码457个氨基酸残基,经Blast分析,该基因与GenBank中其他13株N8亚型毒株的NA基因核苷酸序列同源性为91.6%～73.3%。与其他8个N1～N9亚型NA基因进行遗传演化分析,N8亚型与N5亚型NA基因的亲缘关系最近,与N3亚型NA基因的亲缘关系最远。结果表明,禽流感病毒N8亚型NA基因序列的测定对N8亚型流感病毒的诊断和预防具有重要意义。     

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。     

Clade2.3.4 H5亚型禽流感疫苗变异候选株的构建

为应对Clade2.3.4H5亚型禽流感病毒持续发生的抗原性改变及其引发的潜在的地方性流行,需要根据流行监测的抗原分析结果制备疫苗候选株。采用反向遗传操作系统,以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)AIV的内部基因为骨架,以Clade2.3.4H5N1亚型AIV A/chicken/Hebei/2/2011(wt-HB株)的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因为供体,并删除wt-HB株HA基因中编码多碱性氨基酸的序列,成功拯救出1株重组病毒rHB/PR8。该病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖性能,对SPF鸡和鸡胚无致病性。这一研究结果为防控变异的Clade2.3.4H5亚型禽流感提供了良好的疫苗候选株。     

野鸭源H3N8亚型禽流感病毒的系统进化和分子遗传特征分析

为了解在江苏某湿地野生水禽中分离到的1株禽流感病毒的来源、流行特点、进化和分子遗传特征,将采集的野生水禽粪便经处理后,使用A型禽流感通用荧光RT-PCR检测,阳性样品接种10日龄SPF鸡胚,收取接种后第24~96小时的尿囊液,进行血凝试验,随后对其进行全基因测序和遗传进化分析。结果显示,该毒株为H3N8亚型禽流感病毒,命名为A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)。HA蛋白的裂解位点氨基酸序列为PEKQTR↓GLF,无连续碱性氨基酸插入,符合典型低致病性禽流感病毒的特征;HA与NA的糖基化位点没有发生突变;NA耐药性氨基酸位点出现突变位点;PB2蛋白第627和701位氨基酸分别为谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asn),是禽源流感病毒的特征性氨基酸。在Gen Bank中对该毒株进行序列比对分析,结果显示,与所测基因片段同源性最高的10株毒株基本位于我国东部候鸟迁徙路线上。结果表明,A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)株为从江苏分离的低致病性禽流感病毒,基因主要来源于我国东部候鸟迁徙路线上的禽流感病毒。     

三株鸭源H9N2亚型禽流感病毒福建株全基因的测序及遗传进化分析

为明确3株鸭源H9N2亚型禽流感病毒福建株A/Muscovy duck/Fujian/CL/1997(H9N2)(简称CL株)、A/duck/Fujian/MH/2003(H9N2)(简称MH株)和A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)(简称FQ2株)全基因组的分子特征和遗传进化情况,采用RT-PCR方法扩增这3株病毒全基因片段,并进行序列比较及遗传进化分析。结果表明,所克隆的8个基因片段均有完整的开放阅读框,其血凝素基因蛋白裂解位点的氨基酸组成为-RSSR*GLF-,为不连续的碱性氨基酸,其静脉接种指数远小于1.2,均符合低致病性AIVHA蛋白裂解位点特征;CL株和MH株的HA基因在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94群系;FQ2株HA基因在遗传进化上属于DK/HK/Y280/97群系,3株H9N2亚型AIV HA基因在遗传进化上均属于经典的欧亚种系。3株H9N2亚型AIV NA基因颈部均存在缺失,CL株和MH株的NA基因在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94群系,FQ2株NA基因在遗传进化上属于G1群系。CL株和MH株的其他6个基因在遗传进化上均和经典的CK/BJ/1/94一致,而FQ2株则可能是由不同流感病毒基因亚系间发生自然重排的产物。     

H9N2亚型禽流感病毒华东分离株的生物学特性及遗传进化分析

对从华东地区分离的6株鸡源H9N2亚型禽流感病毒进行了生物学特性及血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的分子遗传进化分析.发现这6株病毒对SPF鸡无致病性,IVPI均为0,可被单克隆抗体4E7分为2个亚群.序列分析表明,这6株病毒的HA基因裂解位点处的氨基酸序列均为RSSR↓GLF,Ck/HD/16/07和Ck/HD/112/05的潜在糖基化位点与其他4株不一致;NA基因为N2亚型,其中4个毒株的茎部缺失3个氨基酸,而另2个毒株无缺失.     

H5N1亚型禽流感病毒NA基因在重组禽痘病毒中的表达及其产物的免疫原性

将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)株的NA基因及LacZ报告基因克隆到禽痘病毒载体pSY681中,构建重组转移载体pSY(NA+LacZ),将其转染鸡胚成纤维细胞,经蓝白斑筛选,纯化表达NA基因的重组禽痘病毒rFPV-NA,用其免疫SPF鸡,检测该重组禽痘病毒的免疫原性。结果显示,该重组禽痘病毒能够在体外培养细胞内表达具有生物学活性的NA蛋白,表达产物的分子质量约为55 ku;用该重组禽痘病毒免疫SPF鸡后,能够使免疫鸡获得对H5N1和H7N1两种亚型HPAIV攻击的部分保护。表明,重组禽痘病毒rFPV-NA具有良好的免疫原性。     

H5N1亚型禽流感病毒HA基因在sf9细胞中的表达

本研究选用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有H5N1亚型禽流感病毒HA主要抗原基因的重组杆状病毒,并感染sf9昆虫细胞表达HA抗原蛋白。首先,分析禽流感病毒H5N1亚型HA基因编码的氨基酸序列,选取抗原表位集中特异性保守的HA序列,构建重组供体质粒p Fast HA,转化DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR检测,获得重组穿梭载体Bacmind HA。脂质体法转化对数生长期的sf 9昆虫细胞,获得重组杆状病毒r Bac HA。经Western-blotting检测及间接免疫荧光(IFA)分析,结果表明,HA蛋白在sf9昆虫细胞中正确表达,分子质量约为45 ku,并具有良好的反应原性。为进一步研制H5N1亚单位疫苗的研发及研制H5亚型ELISA抗体试剂盒奠定了基础。     

鸭源H5N1亚型禽流感疫苗候选株的构建

H5N1亚型clade 2.3.4为我国南方地区的优势毒株.A/mallard/Huadong/S/2005(S)病毒在遗传进化上属于clade 2.3.4,而A/mallard/Huadong/Y/2003(Y)病毒属于clade 2.通过删除S病毒和Y病毒的HA多碱性氨基酸序列,S病毒由PLRERRRKRGL改变为PLREGRGL,Y病毒由PQRERRKKRGL改变为PQREGRGL,使之成为低致病性特征的HA基因.将S病毒和Y病毒的NA基因和突变的HA基因分别组合,由A/Puerto Rico/8/34(PR8)病毒提供6个内部基因,进行拯救,共获得4个致弱病毒(SS,SY,YS,YY).这4个致弱病毒对SPF鸡的静脉内致病指数(IVPI)为0,对10日龄SPF鸡胚无致病性.SS、SY、YS、YY病毒第10代鸡胚尿囊液的HA效价分别为9、11、11、11 1b.     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒(AIV)分离株血凝素(HA)基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析。结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸。2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79(H7N1)的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94(H7N2)株同源性很低(仅65.0%),而与以色列、意大利H7N2AIV的同源性较高(为96%~97%);2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内。推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸(R-)残基,符合低致病力AIV的基因特征。     

两株家鸭禽流感病毒H3N1亚型分离株的致病性及其表面糖蛋白基因序列分析

测定了2株禽流感病毒(AIV)Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04对SPF鸡和BALB/c小鼠的致病性；对其血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因的序列进行了测定,并与GenBank中收录的其他序列进行了比较。结果,此2株AIV对SPF鸡具有较低的致病性,而对BALB/c小鼠无致病性；Dk/YZ/231/02株的HA基因与Dk/Ukraine/1/63(H3N8)株的同源率最高,Dk/YZ/3/ 04株的HA基因与Petbird/HK/1559/99(H3N8)株的同源率最高；而Dk/YZ/231/02株的NA基因与Dk/Fujian/17/2001(H5N1)株的同源率最高,Dk/YZ/3/04株的NA基因与Gs/Guangdong/ 1/96(H5N1)株的同源率最高。进化分析结果表明,Dk/YZ/231/02和Dk/YZ/3/04株的NA基因均可能起源于水禽源H5N1亚型AIV,这可能是不同亚型AIV在水禽体内基因重组的结果。推导的氨基酸剪切位点序列均为PEKQTR,属于非高致病性AIV的特征序列。     

H9N2禽流感病毒HA2基因重组杆状病毒的表达

从pMD18-T-HA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的 HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和 Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27 ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2 融合蛋白可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。     

禽流感重组禽痘病毒疫苗不同途径及剂量接种的免疫效力

将表达禽流感病毒 (AIV)H5HA和N1NA基因的重组禽痘病毒 (rFPV HA NA)以不同剂量分别经翅下刺种、肌肉注射、皮下注射、点眼及滴鼻途径接种于 4周龄SPF鸡。结果 ,该疫苗经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种的SPF鸡 ,能够诱导其产生血凝抑制 (HI)抗体 ;用10 0LD50 的HPAIVA/Goose/Guangdong/ 1/ 96 (H5N1)毒株攻击后 ,免疫鸡无一发病和死亡 ,免疫保护率为 10 0 %。以点眼和滴鼻途径免疫的SPF鸡 ,大剂量接种能够诱导产生一定水平的抗体 ,攻毒后的保护率分别为 83.3%、6 6 .7% ;而小剂量接种则不产生免疫反应 ,保护率为 0。表明rFPV HA NA疫苗只有经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种 ,才能够诱导机体产生高水平的免疫力。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化

用RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Zhejiang/12/00中获得NA基因,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a中,将序列测定和双酶切验证准确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导,经SDS-PAGE和Western-blot分析,结果显示,重组蛋白得到了可溶性表达,表达的蛋白质分子质量为33 ku;该蛋白可以与禽流感H5N1亚型阳性血清反应,具有良好的免疫原性;ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性。     

H4和H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单因子血清的制备

为制备H4和H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白特异性单因子血清,以便快速鉴定H4以及H6亚型禽流感病毒,根据GenBank中A/Duck/Hunan/S11090/2012(H4N6)和A/Chicken/Guangdong/S1312/2010(H6N2)的血凝素基因序列,人工合成并进行密码子优化后插入真核表达载体pCAGGs,通过双酶切鉴定以及测序确定重组质粒构建成功。给每只SPF鸡注射免疫200μg重组质粒,免疫周期为30d,第3次免疫后第10天,通过心脏采血收获单因子血清。间接免疫荧光试验和Western-blot试验的结果表明,重组质粒中HA基因均被成功表达。利用H4和H6亚型禽流感病毒抗原进行血凝抑制试验,结果显示抗体效价均在64至128之间,表明制备的单因子血清抗体效价较高,敏感性强。使用其他亚型的禽流感病毒以及新城疫病毒为抗原进行血凝抑制试验发现结果均为阴性,表明制备的单因子血清与其他亚型禽流感病毒及新城疫病毒无交叉反应。     

猪流感病毒分离株HA基因的克隆与序列分析

从1株H3N2亚型猪流感病毒(SIV)中提取RNA,用RT-PCR方法扩增了其HA基因的全长cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果,扩增的H3N2亚型SIV HA基因长度为1 701个核苷酸,共编码566个氨基酸。核苷酸序列与已发表的中国香港、中国大陆、美国及欧洲分离的H3亚型毒株相近,核苷酸和氨基酸序列相似性均在97%以上,同属H3亚型。其HA1、HA2之间切割位点序列为PSIQSR↓G,从分子水平推论,属于非高致病力毒株。其推导的氨基酸序列中有8个糖基化位点,7个位于HA1基因的第8、22、38、63、126、165、285位点,1个位于HA2基因的154位点。研究数据已提交至GenBank,并申请到一个登录号EF569597。研究结果为我国流感病毒基因库的建立、流感疫情的监测和防制提供了理论依据和技术资料储备。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T-HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒(AIV)HA1基因,并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1,与线性化杆状病毒DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经3次蚀斑纯化,得到重组杆状病毒rpBlueHisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示,HA1在昆虫细胞中得到表达,且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明,重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明,重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

欧洲禽源NA和M基因对重组猪流感病毒致病性的影响

为探究欧洲禽源N A和M基因对重组猪流感病毒致病性的影响,通过对猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07(H 1N2)(S12)与A/swine/Zhejiang/1/07(H1N1)(Z11)进行测序以及基因型分析,确定了2009甲型H1N1流感病毒的PB 2、PB1、PA、HA、NP和NS基因均起源于三源重组H1N2亚型SIV(S12),NA和M基因均起源于欧洲禽源H1N1亚型SIV(Z11)。利用RT-PCR技术对Z11的NA和M基因分别进行扩增及克隆,以S12为骨架,成功拯救到含有欧洲禽源NA、M基因的重组病毒。通过检测不同病毒在MD CK、A549、PK15细胞上的生长特性,并以小鼠为模型对不同病毒的致病性进行了差异性分析。研究结果表明,欧洲禽源H1N1亚型SIV的NA和M基因相互协同地提高了病毒在体外多种细胞以及小鼠肺内的复制能力,增强了病毒对小鼠的致病性,这为甲型H1N1流感病毒的分子致病机制研究提供了理论依据,对猪流感的防控及预警具有重要意义。     

H5亚型禽流感病毒样颗粒的制备及其免疫原性的初步研究

本研究采用RT-PCR方法扩增2.3.4.4分支H5亚型高致病性禽流感病毒HA、NA和M1基因,亚克隆至穿梭载体p FastBac1,然后转化至DH10Bac感受态细胞,筛选重组杆粒。将阳性重组杆粒共转染至sf9昆虫细胞,构建病毒样颗粒(VLPs),通过血凝和血凝抑制试验、透射电镜、Western-blot等方法鉴定。利用蔗糖密度梯度超速离心浓缩纯化VLPs,选择不同剂量VLPs免疫6周龄SPF鸡,评价其免疫原性。结果显示,成功构建重组杆粒,转染的sf9细胞出现皱缩、变形、融合、囊泡化等特征性病变;在细胞盲传3代后,含有VLPs的细胞上清液的血凝效价可达1∶2~7;Western-blot证实3个目的蛋白均成功表达;透射电镜观察结果表明,VLPs与天然禽流感病毒颗粒具有相似的形态特征;动物试验结果表明,二免后2周,血清抗体效价最高可达到1∶2~(10),抗体亚型主要为Ig G1。本研究首次成功构建了2.3.4.4分支H5亚型禽流感VLPs,为开发新型、安全、高效的H5亚型禽流感疫苗奠定了基础。     

重组鸡痘病毒首免与灭活疫苗加强免疫对高致病性禽流感免疫效果的影响

用表达H5亚型禽流感病毒(AIV)HA与NA基因的重组鸡痘病毒(rFPV)rFPV-12LSH5NA对10日龄带有H5亚型AIV母源抗体的商品鸡进行了首次免疫,17日龄时再用H5亚型AIV全病毒灭活疫苗加强免疫.免疫鸡分为2个批次,分别在24和31日龄用H5亚型AIV进行致死性攻击.在24日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于17日龄全病毒灭活疫苗单独免疫组(16/17).在31日龄攻毒组中,rFPV首免与全病毒灭活疫苗加强免疫组的死亡比例(0/17)显著低于10日龄rFPV单独免疫组(6/17).结果显示,在鸡群普遍存在针对H5亚型AIV母源抗体的情况下,rFPV首免与全病毒灭活疫苗配合使用能使鸡体快速建立坚强的免疫保护反应,是一种非常有效的免疫策略.