鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因的遗传变异分析

对鸽源冠状病毒PSH株纤突蛋白基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序。结果表明,PSH株S基因由3 504个核苷酸组成,编码1条由1 167个氨基酸残基组成的多肽。S基因编码产物裂解后形成的S1和S2亚单位分别由541和626个氨基酸残基组成。PSH株S蛋白切割识别位点为精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-精氨酸(RRFRR),与多数鸡传染性支气管炎病毒(IBV)切割识别位点相似(RRF/SRR)。与GenBank中其他冠状病毒毒株S基因的推导氨基酸序列相比较,PSH株与IBV参考毒株的同源性为79.3%~99.6%,而与其他冠状病毒包括火鸡蓝冠病病毒和SARS病毒的同源性均小于37.8%。表明,鸽源冠状病毒PSH株属于第3抗原群冠状病毒,且与IBV亲缘关系较近。     

猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

根据猪捷申病毒(PTV)Swine/CH/IMH/03株核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以全长基因组重组质粒pSK-PTVFL为模板扩增了3D基因,并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a(+)中,阳性质粒转化BL21(DE3),阳性菌经0.3 mmol/L IPTG诱导后,进行Western-blotting检测。结果显示,3D蛋白获得了高效表达,表达量占菌体总蛋白的66.1%,且重组蛋白能与PTV Swine/CH/IMH/03株阳性血清发生特异性反应。表明,3D蛋白能在大肠杆菌中高效表达,并具有良好的免疫原性,这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。     

鸡传染性支气管炎病毒HN株5a 5b及N基因的遗传变异分析

从河南省某鸡场中疑似鸡传染性支气管炎(IB)的雏鸡病料中分离到1 株鸡传染性支气管炎病毒(IBV),暂命名为HN,鉴定为IBV。从接种HN毒株的鸡胚尿囊液中提取单股RNA后应用反转录聚合酶链反应(RT PCR)技术扩增得到包含IBV HN株5a、5b蛋白及N蛋白基因的约1 600 bp片段;将克隆测序的5a、5b及N基因分别与GenBank中11 株国内外参考毒株相应基因进行序列比较与遗传变异分析,发现IBV HN株变异独特,明显不同于国内外参考毒株。     

商品疫苗对FMDV O/YNGM/97株的免疫效果评价

利用血清学方法对我国流行毒株O/YNGM/97进行鉴定.并对其生物学特性和免疫学特性进行了研究.结果显示,该流行毒株为O型12蹄疫病毒(FMDV),其对乳鼠和BHK21细胞的适应性比较好,致病性较强,LD50.和TCID50分别为10-6.33/0.2 mL和10-4.75/0.05 mL.VP1基因序列的比较结果显示,O/YNGM/97株与国外FMDV参考毒株O/TAI/1/92的同源性为91.4%,与国内疫苗毒株OZ/93、OA/58和OY/80的同源性分别为79.2%、83.6%和78.99/6.用商品疫苗OZ株、OY株口蹄疫O型灭活疫苗和牛羊.口蹄疫O-Asial型双价灭活疫苗免疫的小鼠均可产生较高的免疫抗体,并对流行毒株O/YNGM/97的攻击具有较好的保护性.说明,使用现有商品疫苗完全可以预防该毒株在我国的流行.     

IBV疫苗株基因组3''''末端序列分析

以5株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗株(D41、H120GD、H120SH、H52BJZH和H52GD株)和IBV标准强毒M41-E4株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出1条特异性条带,包括部分核衣壳蛋白(N)基因以及紧接着N基因下游的基因组3′端非编码区(UTR).测序结果表明,从D41、H120GD和H120SH株扩增的特异性片段长度为614 bp;而从H52BJZH、H52GD和M41-E4株扩增的特异性片段长度为406 bp.序列分析发现,被检的6株IBV毒株可分两组,其中D41、H120GD和H120SH株为一组,核苷酸序列同源性为99.7%～99.8%;而H52BJZH、H52GD和M41-E4株构成另一组,其核苷酸序列同源性为99.3%～100%;两组之间的最大同源性仅为94.6%.在系统发生进化树上,这两组分别位于不同的分支簇上,国内的H52BJZH、H52GD与国外的H52株不在同一分支簇上,相反却与国内强毒M41-E4株以及国外M41株在同一分支簇上.提示国内H52疫苗株与国外H52疫苗株不同,它们在亲缘关系上更靠近M41-E4株和M41株.     

新城疫病毒广西分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)F基因序列设计了2 对引物,对从广西分离的10株NDV毒株的F基因进行了分段扩增和序列测定,其基因序列全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,均有6个潜在的糖基化位点。将其F基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的10株NDV 参考株的F 基因序列进行了比较。结果表明,核苷酸序列的同源性为82.6% ~98.1%,氨基酸的同源性为87.7%~98.7%。这10株NDV广西分离株在裂解位点的氨基酸序列(112R R Q K/R R F117)与NDV强毒株特征相符合。系统发育树、酶切位点分析和基因分型结果表明,10 株NDV广西分离株中GX1/00、GX2/00、GX4/00、GX6/02、GX7/02、GX9/03、GX10/03和GX11/03为基因Ⅶd亚型,GX3/00和GX5/00为基因Ⅲ型。     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

鸡传染性支气管炎病毒SC株S1基因的序列分析

用RT PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)SC株S1基因 ,连接到 pMD 18 T载体上 ,克隆后进行了核酸序列分析 ,证实SC株S1基因与基因库中收录的国外毒株H12 0和M 4 1的同源性较低 ,分别为 81.1%和 80 .0 % ,而与国内JX990 1株的同源性达到 91.3% ,初步证实国内存在IBV新毒株。     

赛鸽新城疫病毒南京分离株的生物学特性及其F和HN基因的分析

从南京市某赛鸽公棚发病鸽脑组织中分离到1株鸽新城疫病毒,命名为Pi/NJ/CH/4416/2016(简称ND4416)。各项生物学特性试验结果表明,该分离株为鸽新城疫强毒,对鸽具有高致病性,对鸡的致病性相对较低。经RT-PCR扩增、测序得到分离株的F基因和HN基因序列。F基因分析表明,其裂解位点的氨基酸序列为~(112)R-R-Q-K-R-F117,是典型的强毒株共有序列。F、HN基因遗传进化分析发现,本次分离株的基因型为Class II,VIb亚型,且与目前国内流行株属于同一遗传分支,这些毒株与比利时流行株PPMV-1/Belgium/11-09620/2011(JX901124.1)的亲缘关系相近,推测近年国内流行毒株可能来源于比利时。本次分离毒株与弱毒疫苗株La Sota(AF077761.1)的遗传距离较远。生物信息学分析显示,该鸽源分离株HN蛋白第491~500位的一个线性抗原表位发生了改变,血清学试验也显示本毒株与La Sota疫苗株的抗原性差异明显,在一定程度上说明该鸽源毒株已经发生了抗原性变异。     

IBV疫苗株基因组3′末端序列分析

以 5株鸡传染性支气管炎病毒 (IBV )疫苗株 (D41、H12 0GD、H12 0SH、H5 2BJZH和H5 2GD株 )和IBV标准强毒M 41E4株的基因组RNA为模板 ,利用RTPCR技术 ,扩增出 1条特异性条带 ,包括部分核衣壳蛋白 (N)基因以及紧接着N基因下游的基因组 3′端非编码区 (UTR)。测序结果表明 ,从D41、H12 0GD和H12 0SH株扩增的特异性片段长度为6 14 2bp ;而从H5 2BJZH、H5 2GD和M 41E4株扩增的特异性片段长度为 40 6 2bp。序列分析发现 ,被检的 6株IBV毒株可分两组 ,其中D41、H12 0GD和H 12 0SH株为一组 ,核苷酸序列同源性为 99.7?.8%;而H5 2BJZH、H5 2GD和M 41E4株构成另一组 ,其核苷酸序列同源性为 99.3 0 %;两组之间的最大同源性仅为 94.6 %。在系统发生进化树上 ,这两组分别位于不同的分支簇上 ,国内的H5 2BJZH、H5 2GD与国外的H5 2株不在同一分支簇上 ,相反却与国内强毒M 41E4株以及国外M 41株在同一分支簇上。提示国内H5 2疫苗株与国外H5 2疫苗株不同 ,它们在亲缘关系上更靠近M 41E4株和M 41株。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎 (IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒 (NIBV)W株 ;再通过SPF鸡胚连续传代 ,获得了NIBV疫苗毒株W93;继而借助RT PCR法扩增了其S1基因 ,并测定了S1基因的核苷酸序列 ,分析了与相关毒株间的同源性。结果显示 ,W93株在鸡胚中的病毒产量达 10 7.8EID50 /0 .1mL ,适用于所有日龄的雏鸡 ;W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M4 1株、H52 株和H12 0 株的同源性很高 ,分别为 96 .9%、96 .8%和 97.1%。表明 ,W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株     

鸭源H10亚型禽流感病毒血凝素基因的序列分析及其致病特性

采用血清学试验和RT-PCR方法从华东地区家养水禽中分离鉴定出多株H10亚型禽流感病毒,对其中1株A/Duck/Yangzhou/502/2003(简称Dk/YZ/502/03)的血凝素(HA)基因进行了序列测定,并与GenBank中登录的其他序列进行了比较。结果显示,Dk/YZ/502/03株血凝素基因与哺乳动物水貂分离株A/Mink/Sweden/84(H10N4)的同源性最高;其推导的氨基酸剪切位点序列为P-E-I-M-Q-G-R,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列,这与该毒株对SPF鸡和BALB/c小鼠的低致病特性相吻合。     

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株S1基因的序列分析

采用RTPCR方法扩增了12株鸡传染性支气管炎病毒中国分离株的全长S1基因,并进行了序列分析。通过与GenBank中登录的其他IBV参考毒株S1基因序列比较,进行了系统进化分析。结果表明,12株分离毒株属于同一个进化群的2个不同进化亚群。其中11株分离株与国内一些分离株亲缘关系最近,属于同一进化亚群,而广西分离株GX041则与欧洲毒株4/91亲缘关系较近,属于另一亚群。这些结果说明,中国各地的流行毒株变异较大,实际免疫中要根据流行毒株的特性选择合适的疫苗株来进行。     

鸡传染性支气管炎病毒SY毒株生物学特性及其S1基因分子遗传变异分析

通过生物学特性研究 ,验证了分离自沈阳地区的SY毒株确实为 1株鸡传染性支气管炎病毒。病毒中和试验表明 ,SY血清型不同于参考毒株T、H52 、M41及国内其他流行株如HD、XB、DB等 ;S1基因序列分析表明 ,SY核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考毒株Beau、M41、H12 0 、N1 62、Gray、6/ 82和Ark99等毒株的同源率都低于 80 % ,进化关系与各参考毒株也相距甚远 ,糖基化位点出现 3个新位点 ,氨基酸疏水性区域也存在差异。     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒D971毒株S1基因的序列测定与分析

采用RT PCR方法扩增了鸡传染性支气管炎病毒D971毒株预期的 163 6bp的S1全基因DNA片段 ;以Sanger’s双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列 ,推导出了氨基酸序列 ,并用有关软件构建了S1基因进化树。结果表明 ,IBV D971毒株与国内外AF14 0 3 5 2 (山东农业大学 )、AF15 4841(山东农业大学 )、AF193 43 2 (青岛动物检疫所 )、AY0 43 3 12 (中国农业大学 )、AF3 975 2 8(四川农业大学 )、AY0 43 2 2 1(浙江农业大学 )、AF3 5 2 3 12 (浙江农业大学 )、U2 95 2 2 (澳大利亚 )和M2 1883 (英国 )毒株的核苷酸同源性分别为 99%、99%、95 %、94%、87%、86%、88%、82 %和 80 % ,氨基酸序列同源性依次分别为 93 %、93 %、87%、86%、83 %、83 %、82 %和 80 %。     

ELISA双抗夹心法检测鸡IBV的研究

用差速离心结合不连续蔗糖密度梯度纯化的鸡传染性支气管炎病毒抗原免疫兔和鸡,获得高效价的多克隆免疫血情。经鸡胚胚体乳剂吸收和过DEAE-52纤维素柱提纯其IgG,建立了检测鸡传染性支气管炎病毒抗原的ELISA双抗体夹心法。应用本ELISA对人工感染鸡和传染性支气管炎病鸡群的气管样本的检测,其病毒抗原阳性检出率分别为10O％(20/20)和78％(39/50)。实验结果表明,ELISA双抗体夹心法对鸡传染性支气管炎的早期诊断具有简单、快速、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。     

禽大肠埃希氏菌融合菌株疫苗的研制及应用

对从陕西省主要养鸡地区病死鸡分离的禽致病性大肠埃希氏菌进行Omp分型 ,用不同Omp型的菌株构建成融合菌株。用融合菌株制作铝胶灭活疫苗 ,与单价疫苗和两亲本菌株双价疫苗的免疫保护效果进行比较。结果表明 ,融合菌株疫苗可对多种O血清型致病性大肠埃希氏菌的攻毒试验产生坚强的保护 ,保护率高达 93%～ 10 0 % ,而O血清型单价疫苗的保护率仅 6 7%～80 % ,双价疫苗的保护率仅 80 %。在生产中对蛋用鸡的应用结果表明 ,融合菌株疫苗可明显降低鸡的死淘率。     

鸭传染性腔上囊病毒VP2基因的克隆与序列分析

应用RT PCR法对分离于当地典型发病鸭群的鸭传染性腔上囊病毒 (IBDV )YL997株进行了VP2基因的克隆与序列分析 ,并和相关毒株进行了比较。结果表明 ,YL997株与STC株的核苷酸和氨基酸同源性只有 92 .5 %和 91.8% ,与超强毒株UK6 6 1的核苷酸和氨基酸同源性均为97.6 % ,而与当地鸡群中分离的超强毒株HN94 2的核苷酸和氨基酸同源性则高达 98.1%和98.4 % ,该毒株的VP2基因序列完全具备了超强毒株的主要特征。