IBV疫苗株基因组3''''末端序列分析

以5株鸡传染性支气管炎病毒(IBV)疫苗株(D41、H120GD、H120SH、H52BJZH和H52GD株)和IBV标准强毒M41-E4株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出1条特异性条带,包括部分核衣壳蛋白(N)基因以及紧接着N基因下游的基因组3′端非编码区(UTR).测序结果表明,从D41、H120GD和H120SH株扩增的特异性片段长度为614 bp;而从H52BJZH、H52GD和M41-E4株扩增的特异性片段长度为406 bp.序列分析发现,被检的6株IBV毒株可分两组,其中D41、H120GD和H120SH株为一组,核苷酸序列同源性为99.7%～99.8%;而H52BJZH、H52GD和M41-E4株构成另一组,其核苷酸序列同源性为99.3%～100%;两组之间的最大同源性仅为94.6%.在系统发生进化树上,这两组分别位于不同的分支簇上,国内的H52BJZH、H52GD与国外的H52株不在同一分支簇上,相反却与国内强毒M41-E4株以及国外M41株在同一分支簇上.提示国内H52疫苗株与国外H52疫苗株不同,它们在亲缘关系上更靠近M41-E4株和M41株.     

鸡传染性支气管炎病毒SC株S1基因的序列分析

用RT PCR扩增了鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)SC株S1基因 ,连接到 pMD 18 T载体上 ,克隆后进行了核酸序列分析 ,证实SC株S1基因与基因库中收录的国外毒株H12 0和M 4 1的同源性较低 ,分别为 81.1%和 80 .0 % ,而与国内JX990 1株的同源性达到 91.3% ,初步证实国内存在IBV新毒株。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎 (IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒 (NIBV)W株 ;再通过SPF鸡胚连续传代 ,获得了NIBV疫苗毒株W93;继而借助RT PCR法扩增了其S1基因 ,并测定了S1基因的核苷酸序列 ,分析了与相关毒株间的同源性。结果显示 ,W93株在鸡胚中的病毒产量达 10 7.8EID50 /0 .1mL ,适用于所有日龄的雏鸡 ;W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M4 1株、H52 株和H12 0 株的同源性很高 ,分别为 96 .9%、96 .8%和 97.1%。表明 ,W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株     

4株猪瘟流行野毒株病毒结构蛋白E2基因的核苷酸序列分析

应用RT-PCR和nPCR扩增由4株甘肃省近期(1997-1998)猪瘟流行野毒株的E2基因,将其克隆到pGEMTEasy载体上,经转化、筛选、鉴定后,测出核苷核序列.4株流行毒株的E2基因核苷酸序列同源性为89.2%-99.7%,相应的氨基酸序列同源性为93.8%-99.0%.这4株流行毒株;与C-株(疫苗种毒)E2基因的核苷酸序列同源性为82.2%-84.3%,相应的氨基酸序列同源性为87.9%-90.2%,表明近期猪瘟流行毒株与C-株的gp55蛋白之间存在一定的差异.     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒,命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验,证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段,经测序,并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明,HH06株S1基因由1 620个核苷酸组成,推导的多肽由540个氨基酸残基组成,推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低,亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

猪非典型瘟病毒GX01-2018株全基因组分子特征的分析

猪非典型瘟病毒(APPV)被证实是新生仔猪先天性震颤的致病因子。为了解广西APPV流行毒株的分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增APPV阳性病料,经克隆、测序、拼接,获得1株APPV的全基因序列,遂被命名为GX01-2018株。结果显示,GX01-2018株基因组全长11 565 bp,包括一个编码3 635个氨基酸的阅读框(ORF)。同源性分析显示,GX01-2018株与国内代表毒株广西GX-CH_2016株、江西JX-JM01-2018A01株、广东China/GD-SD/2016株、广东GD株核苷酸序列的同源性分别为98.2%、92.9%、83.4%、90.8%。GX01-2018株与国外代表毒株美国000515株、德国Bavaria_S5/9株、奥地利AUT-2016_C株、荷兰NL1株核苷酸序列的同源性分别为87.8%、90.7%、90.5%、90.7%。上述国内外代表毒株间Npro、Erns、E2基因核苷酸序列的同源性分别为79.1%～97.2%、83.0%～98.4%、83.1%～96.8%。基于APPV全基因组以及E2、Npro、Erns基因核苷酸序列绘制遗传进化树,获得相似的进化树图。来自广西的GX01-2018株与欧洲型毒株位于一个分支,而同样来自广西的GX04/2017株与美洲型毒株位于另一个分支。表明APPV流行毒株具有遗传多样性,来自同一地区的流行毒株出现较大的遗传变异。     

猪非典型瘟病毒的基因组特征分析及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

最近的研究表明,猪非典型瘟病毒(APPV)在我国猪群流行,并造成了严重的危害。本研究应用RT-PCR方法对APPV GD3株进行了全基因组扩增、测序,并进行了全基因组及其部分编码基因的遗传演化分析;根据APPV基因组编码的结构蛋白E2的基因序列,构建了APPV的荧光定量RT-PCR检测方法。APPV GD3株的全基因组序列与德国、美国、荷兰和西班牙毒株在不同的进化分支上,同源性为83.1%~83.4%;与中国毒株GD1、GD2和GD的同源性分别为99.5%、99.6%和83.4%。GD3株编码的E2、Npro和Erns基因与国内外现有毒株的同源性分别为83.1%~99.7%、80.2%~99.8%和81.9%~99.5%。本研究建立的荧光定量RTPCR检测方法特异性强、最低检测浓度为10 copes/L、操作简单、耗时短,具有良好的兽医临床应用前景。     

鸡传染性喉气管炎病毒安徽株AH-XY15的分离鉴定

安徽省某鸡场120日龄蛋鸡发生疑似鸡传染性喉气管炎(ILT),根据Gen Bank发表的鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)株g D基因设计合成1对特异性引物,从发病鸡喉头及其分泌物中扩增出1 134 bp大小片段。将病鸡喉头气管及其分泌物处理后接种SPF鸡胚,接种120 h后在绒毛尿囊膜(CAM)上形成典型痘斑,证实分离到1株鸡传染性喉气管炎病毒,命名为AH-XY15株。应用鸡胚传代的第4代病毒感染5日龄健康麻羽鸡,结果感染鸡出现了典型ILT临床症状,并能够从发病鸡喉头分泌物检出ILTV。应用PCR扩增分离株毒力基因TK基因和g B基因,序列分析显示,AH-XY15分离株TK、g B基因的核苷酸序列与国内WG株、国外USDA株以及国内疫苗株K317株同源性均在99%以上,氨基酸序列同源性在97%~99.8%之间。     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA ,根据已报道的猪瘟病毒基因组序列 ,设计合成了 2对引物 ,以总RNA为模板 ,利用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)、套组聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术 ,对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的 5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定 ,用DNAstar软件比较分析了 5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株 (C ST株 )E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现 ,5株野毒与C ST株核苷酸序列的同源性为 81.7%～ 83.1% ,氨基酸同源性为 87.3%～ 88.6 % ,表明它们之间存在较大的差异 ;但 5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达 98.8%～ 99.3% ,氨基酸同源性为96 .6 %～ 99.2 % ,表明它们之间的差异较小     

伪狂犬病病毒Min-A株gE基因的克隆及序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒 (PRV) gE基因的序列设计了 1对引物 ,对PRVMin A株进行了PCR扩增 ,扩增产物克隆于 pGEM TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序 ,证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明 ,目的片段包含 1个 174 0bp的开放性阅读框(ORF) ,编码由 5 79个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明 ,PRVMin A株与PRVEa株、SH株gE基因的核苷酸同源性分别为 99.2 %、98.7% ;推导氨基酸的同源性分别为 98.6 %、97.2 %。     

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌 (APP) 7型的DNA提取物中扩增出大小为 2 873bp的APXⅡA基因片段 ;将PCR产物重组到质粒载体 pMD 18 T中 ,并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明 ,克隆片段为完整的目的基因 ,该片段的核苷酸序列与国外分离株M 30 6 0 2的同源性达 99.7%。     

鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株M蛋白基因的变异及其B细胞表位稳定性

以陕西8株鸡传染性支气管炎病毒(AIBV)分离株M蛋白的基因序列为基础,应用DNAStar软件中的MegAlign模块对其进行了同源性分析;用Kyte-Doolittle方法、Jameson-Wolf方法、Karplus-Schulz方法、Plot-Emini方法和Garnier-Robson方法综合预测了其中4株代表毒株的M蛋白B细胞抗原表位和二级结构。结果,8株AIBV的M蛋白主要在10~40 aa和90~175 aa处存在无规律的点突变,与参考毒株H52、M41、SAIB20、LX和Gray的M蛋白的核苷酸序列和预测的氨基酸序列的同源性分别介于87.4%~99.5%和96.3%~99.5%;分离株间的核苷酸序列和预测的氨基酸序列同源性分别介于91.8%~99.8%和95.4%~100%。4株代表株的M蛋白B细胞优势抗原表位都在159~164 aa和181~193 aa肽段区(这2个区域都包含了无规则卷曲和β-转角结构)或其附近。结果表明,AIBV分离株的M蛋白基因相对保守,只存在无规律的点突变,该变异对AIBV M蛋白B细胞表位的稳定性无影响。     

牛疱疹病毒1型洛精株gD基因的分子克隆及序列分析

根据已发表的牛疱疹病毒1型(BHV-1) P8-2株gD基因的核苷酸序列设计了1对特异性引物,对我国BHV-1洛精株gD基因进行PCR扩增,并对其克隆、测序和分析.结果表明,gD基因的核苷酸长度为1 251 bp,其编码417个氨基酸;BHV-1洛精株gD与国外报道的P8-2株的gD基因的核苷酸的同源性高达99.92%,氨基酸的同源性高达100%.这说明BHV-1的gD糖蛋白高度保守.     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物,对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pMD 18-T载体上,分别获得了全长为817、851、8548、54 bp的全基因序列。序列分析结果表明,新疆毒株间的核苷酸同源性为97.8%~98.9%,氨基酸同源性为96.5%~98.7%,与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较,同源性为90.0%~99.4%;与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较,同源性为81.4%~99.3%。系统进化树分析表明,新疆株独立分支。     

犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达

从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV-JS12株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pH10可使病毒失去感染性,56℃作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列分析时CPV-JS12为CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%~99.6%和98.3%~99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%~99.7%和97.9%~99.7%之间;16个中国分离株处在不同组,CPV-JS12株与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系较近。对CPV-JS12与免疫毒株VP2蛋白的立体结构分析比较,发现有9处氨基酸残基变异,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中表达,重组VP2蛋白的分子质量为67.0ku,主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析中重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组VP2蛋白为抗原建立的CPV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

H5亚型禽流感病毒HA蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备Clade 2.3.2分支H5亚型禽流感病毒HA蛋白的单克隆抗体,以灭活的超速离心浓缩纯化的H5N1亚型禽流感病毒A/duck/Guangdong/S1322/2010(DK/GD/S1322/2010)免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠。取免疫后小鼠脾细胞,使其与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,通过血凝抑制(HI)和ELISA方法筛选,共获得2株能够稳定分泌HA蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株A4和D11。2株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链均为κ链。经HI检测,A4和D11的细胞培养上清和腹水的抗体效价分别为23、22和211、211。HI和中和试验结果显示,这2株单克隆抗体与Clade 2.3.2.B分支和Clade 2.3.2.C分支的病毒反应性良好,而与Clade 2.3.4和Clade 7分支的病毒均不反应。间接免疫荧光试验结果表明,这2株单克隆抗体能够识别MDCK细胞内感染的H5亚型禽流感病毒DK/GD/S1322/2010。结果表明,本研究制备的2株单克隆抗体为H5亚型禽流感病毒的检测和诊断奠定了物质基础。     

腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒D971毒株S1基因的序列测定与分析

采用RT PCR方法扩增了鸡传染性支气管炎病毒D971毒株预期的 163 6bp的S1全基因DNA片段 ;以Sanger’s双脱氧末端终止法测定出其核苷酸序列 ,推导出了氨基酸序列 ,并用有关软件构建了S1基因进化树。结果表明 ,IBV D971毒株与国内外AF14 0 3 5 2 (山东农业大学 )、AF15 4841(山东农业大学 )、AF193 43 2 (青岛动物检疫所 )、AY0 43 3 12 (中国农业大学 )、AF3 975 2 8(四川农业大学 )、AY0 43 2 2 1(浙江农业大学 )、AF3 5 2 3 12 (浙江农业大学 )、U2 95 2 2 (澳大利亚 )和M2 1883 (英国 )毒株的核苷酸同源性分别为 99%、99%、95 %、94%、87%、86%、88%、82 %和 80 % ,氨基酸序列同源性依次分别为 93 %、93 %、87%、86%、83 %、83 %、82 %和 80 %。     

猪瘟流行毒株E2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

用RT PCR方法扩增了陕西省近期猪瘟流行野毒株E2基因 ,并将其克隆到 pMD 18 T载体 ;经转化、筛选、鉴定后 ,测定了核苷酸序列 ,根据C株、Brescia株和Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行 gp5 5氨基酸序列推导 ,并进行同源性比较。结果表明 ,该猪瘟流行毒株的E2核苷酸序列与C株、Brescia株和Alfort株的E2核苷酸序列同源性分别为 81.9%、83.4 %和83.5 % ;相应地 ,gp5 5氨基酸同源性分别为 94 .8%、95 .6 %和 95 .3%。将此E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体 pFastBacHTb后获得了重组质粒 pFBHT E2 ,进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中 ,发生转座作用 ;经抗性及蓝白斑筛选得到了含E2基因的重组DNA ,将其命名为rBacmid E2。此研究为进一步在昆虫细胞中表达E2基因、开发研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了ORF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中,筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB-ORF2。对质粒中的插入片段测序后,应用DNAStar序列分析软件,对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果,3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100%;它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高,达99.5%。     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株L基因的同源性为 99.0 % ,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。